چکیده:

 در این پروژه، یک سیستم نوین از داربست های الکتروریسی شده زیست فعال به منظور مهندسی بافت مثانه با هدف کمک به تمایز سلولی در قاز و همچنین استفاده از ان برای رگزایی و تشکیل بافت در فاز in vivo، ارائه شده است که معایب سیستم های مرسوم داربست های زیست فعال (از جمله ناپایداری پروتئین، عدم توانایی در کنترل رهایش پروتئین و پیچیدگی های عملیاتی سیستم) را دارا نمی باشد. در ابتدا نانوذرات کیتوسان انباشته شده با پروتئین بر اساس کراسی لینک یونی پلی کاتیون کیتوسان و پلی آنیون سدیم تری پلی فسفات تهیه شد. ماکزیمم درصد انباشت پروتئین (۸۰٪ برای BSA و 0%99 برای TCiF-Bl) و قطر متوسط نانوذرات ۵۱ نانومتر می باشند. سپس فیبر پلی کاپرولاکتون حاوی نانوذرات کیتوسان انباشته شده با پروتئین با آرایش موازی و قطر ۲ میکرومتر به روش الکتروریسی ساخته شد. در ادامه به منظور زیست شبیه کردن داربست به بافت مثانه و تامین خواص مکانیکی لازم جهت حمایت از سلول و تأثیر بر تمایز سلول بنیادی مزانشیمی و در نهایت تشکیل بافت با الاستیسیته ی کافی جهت انبساط و انقباض موجود در این بافت، از هیبرید سPCL حاوی نانوذرات کیتوسان و PLLA استفاده شد که نسبت قطری مشابه فیبر کلاژن و الاستین در ماتریکس خارج سلولی بافت مثانه را برآورده کرد. در این کار تحقیقاتی به منظور پایدار کردن رهایش پروتئین و از بین بردن رهایشی اولیه، از ساختار چند لایه ای نانوفیبری – PLLA بهره جستیم و در نهایت همانطوری که انتظار می رفت، پروفایل پایداری از رهایش پروتئین در داربست نانوفیبری چند لایه حاصل شد. در ادامه تست MTT برای داربست های که نتایج آن از سایت چسبندگی کافی داربست های طراحی شده جهت چسبندگی و مهاجرت و تکثیر سلول های بنیادی مزانشیمی به دست آمده از بافت چربی حکایت داشت. در نهایت با سنجش بیولوژیکی فعالیت فاکتور رشد رهایش یافته از داربست با استفاده از T-Cell ها حفظ فعالیت فاکتور رشد توسط این سیستم به اثبات رسید.

کلیدواژه: مهندسی بافت، مثانه، نانوفیبر، نانوذرات، فاکتور رشد، زیست فعال. محیط آزمایشگاهی ” محيط داخل بدن

فهرست مطالب

 فصل اول:مقدمه

۱ – ۴. راهکار مهندسی بافت برای درمان بیماری های مثانه

مهندسی بافت با استفاده از سلول های خودی برای کشت، ممکن است یک راه حلی برای این مشکل ارائه دهد. اخیرا مطالعات متعددی امکان بازسازی مثانه را با استفاده از بخش های مهندسی شده که با زیست مواد و با سلول های خودی کشت داده شده را در شرایط آزمایشگاهی، تایید کرده اند. این رویکرد اساسی برای اولین بار در یک مدل “Subtotal cystectomy سگ سانان مورد آزمایش قرار گرفت که در آن ساختارهای مثانه ی تشکیل داده شده از داربست های طبیعی یا مصنوعی به همراه کشت با سلول های گسترش یافته ی خودی مشتق از مثانه، با موفقیت پیوند داده شدند. این روش در مقایسه با تلاش های قبلی نتایج بهبود یافته ای ارائه داد. با توجه به نتایج امیدوار کننده از چندین مطالعه ی حیوانی، اخیرا یک رویکرد مشابه بر روی تعداد کمی از بیماران مبتلا به اختلال شدید عملکرد مثانه توسط Antony و همکاران انجام شد .آن ها نتایج ۷ بیمار ۴ تا ۱۹ ساله را، با متوسط پیگیری چهار سال، گزارش دادند. هر سه بیمار با بافت های مهندسی شده ساخته شده از کامپوزیت داربست ها (collagen-PGA) افزایش قابل توجهی را در ظرفیت و مطلوبیت مثانه نشان دادند. بافت نمونه از بخش های مثانه به عنوان نشان دهنده ی یک هندسه ی ساختاری مناسب و فنوتیپ سلول های مختلف ، توصیف شد. اگرچه برخی از منفعت های بیماران گزارش شد اما بهبود بالینی حداقل بود. تاکنون اثر این رویکرد جدید به طور مطلوب با روش های بازسازی متعارف با استفاده از بخشی های روده به عنوان منبع مواد، مقایسه نشده است. تا به امروز کاربرد بالینی بافت های مهندسی شده به دلیل فرایند کند تشکیل عروق، سوء تغذیه که منجر به مرگ سلول و تصلب بافت های پیاپی می شود، مختل شده است بازسازی موفقیت آمیز عروق مثانه نیاز به حمایت کوتاه مدت و بلند مدت دارد. علاوه بر این، برای بازگرداندن عملکرد فیزیولوژی مثانه تحریک عصبی مجدد ضروری می باشد . راهکار مهندسی بافت برای بسیاری از بیماری ها، مانند پوست مصنوعی برای بیماران سوختگی، غضروف برای روش های جایگزینی زانو، تزریق ChoImdrocyteS برای درمان refluX VesicO-ureteric، بی اختیاری ادراری به طور بالینی به کار برده شده است. عموما استراتژی برای ارگان های توخالی مانند مثانه، مجرای خروجی مثانه، مری، روده، واژن، یا رگ های خونی در بردارنده ی پیوند یک زیست ماده که متعاقبا به عضو میزبان از طریق مهاجرت سلول ها از بافت های مجاور متصل می شود، است و یا، با پیشرفت های فنی در مهندسی بافت، ترجیحا یک ساختار از پیش ترکیب شده سلول ها و مواد در شرایط آزمایشگاهی می باشد. نیازهای اساسی برای رسیدن به بافت دارای عملکرد، داربست های مناسب، محیط مناسب و سلول های مناسب می باشد.هدف نهائی برای بازسازی یک مثانه ی کاربردی و انقباضی که پاسخگو به کنترل خود به خودی باشد یک چالش مداوم برای آینده می باشد. توانائی ما برای استفاده ی موثر از بافت های کمک کننده به منظور فراهم آوردن شرایط مطلوب برای کشت، زنده ماندن طولانی مدت، تمایز و رشد، اساسی موفقیت در این کار می باشد.همانطوری که پیش تر نیز ذکر شد به منظور رسیدن به مهندسی بافت موفق، سه فاکتور کلیدی می بایست در نظر گرفته شود: سلول ها، داربست ها و بیو مولکول ها (نظیر فاکتور رشد، ژن و غیره).

1-1-مهندسی بافت،لزوم،اهمیت ونگرش ها            2

1-2-نانوتکنولوژی ومهندسی بافت 6

1-3-بیان مسئله:بیماری های مثانه وروشهای درمان سنتی 14

1-4-راهکار مهندسی بافت برای درمان بیماری های مثانه 16

1-5-هدف 29

آرایش رندوم فیبرهای کلاژن والاستین

آرایش رندوم فیبرهای کلاژن والاستین

فصل دوم:طراحی داربست نانوفیبری به منظور مهندسی بافت مثانه

۳-۱-۷-۲. روش نفوذ امولسیون حلال

SabOuTl و همکاران اولین بار نانوذرات به دست آمده توسط این روش را گزارش کردند، که توسط NiiWa و همکاران با به کار بستن PLGA توسعه یافت. این روش بر اساسی خاصیت میسلبیلیتی جزئی یک حلال آلی با آب می باشد. یک امولسیون آبلاروغن از طریق تزریق یک فاز آلی به محلول کیتوسان حاوی عامل پایداری طی همزدن مکانیکی با استفاده از هموژنایزر فشار بالا، حاصل می شود. امولسیون سپس توسط مقادیر بالایی آب، به منظور غلبه بر خاکست میسیبیلیتی حلال آلی در آب، رقیق می شود. رسوب پلیمر به عنوان یک نتیجه ی نفوذ حلال آلی به آب اتفاق می افتد که منجر به تشکیل نانوذرات می شود. این روش برای دارو های هیدروفوب مناسب بوده و درصد راندمان انباشت بالایی را برای این مواد از خود نشان می دهد. عیب های عمده ی این روش شامل شرایط فزایندی نامطلوب (نظیر استفاده از حلال آلی) و استفاده از نیروهای تنشی بالا طی تهیه ی نانوذرات، اشاره کرد

2-1-زیست شبیه سازی 34

2-2-طراحی داربست 42

2-3-اصول الکتروریسی 44

2-4-تکنیک های اصلاح سطحی شبکه نانوفیبری 53

2-4-1-مقایسه روشهای اصلاح سطح      58

2-5-پیشرفت اخیرداربست های الکتروریسی شده با قابلیت رهایش عوامل زیست فعال در داربست 60

2-5-1-تکنیک های ساخت داربست های الکتروریسی شده با قابلیت رهایش بیومولکول    61

2-5-2-چالش ها   67

2-5-3-سیستم نوین وبرتر داربست های زیست فعال 70

2-6-طراحی نهایی 71

2-7-تهیه ی نانوذرات کیتوسان انباشته شده با پروتئین 73

2-7-1-روشهای تهیه ی نانوذرات کیتوسان 74

2-8-چگونگی تاثیرپارامترها برسرعت رهایش ودرصد انباشت پروتئین 80

تاثیر مدول الاستیسیته ی داربست برتمایز سلول بنیادی

تاثیر مدول الاستیسیته ی داربست برتمایز سلول بنیادی

فصل سوم:مواد وروش ها

۳- ۲-. دستگاه پراکندگی دینامیک تا نور (DLS (Dynamic light scattering

پراکندگی دینامیک نور یک تکنیک فیزیکی می باشد که می توان با کمک آن، پروفایل توزیع ذرات کوچک در سوسپانسیون را به دست آورد. ابتدا نانوذرات با غلظت mg/ml 0.1 در حلال دی متیل سولفو اکسید DMSC پراکنده شده و ویسکوزیته ی محلول اندازه گیری شد (CP 2) و در نهایت مورد سنجش DLS قرار گرفت. دستگاه مورد استفاده مدل Mal Vern ساخت کشور انگلستان می باشد. و تحت دمای ۲۵ درجه ی سانتیگراد و فاصله ی اندازه گیری 4/65 میلی متر به مدت ۷۰ ثانیه مورد استفاده قرار گرفت.

3-2-5-دستگاه پراکندگی دینامیک نور DLS

خواص مکانیکی داربست با استفاده از دستگاه اینسترون مدل STM-20, SANTAMساخت ایران در دمای اتاق و منحنی های تنش-کرنش رسم شده، به دست آمد.آرایش دستگاه در شکل قابل مشاهده است. نمونه ها در ابعاد 30mm × 10mm به صورت طولی در دستگاه قرار داده می شود و با سرعت mm/min 50 کشیده می شود. و در نهایت با استفاده از نمودار های تنش-کرنش سه خاصیت مقاومت کششی نهایی، تنش ماکزیمم و مدولی الاستیسیته اندازه گیری شد.

۱-۳-۳. تهیه نانوذرات کیتو سان انباشته شده با پروتئین

نانوذرات کیتوسان بر اساس کراسی لینک یونی بین گروه های با بار مثبت کیتوسان و IPP با بار منفی تهیه می شود. در ابتدا با کمک همزن مغناطیسی کیتوسان در استیک اسید حل شده و پس از آن مقدار مناسب BSA به آن اضافه شده، از آنجایی که 4/7= BSApl . می بایست به منظور افزایش راندمان انباشت pH ،BSA محلول کیتوسان توسط NaOH یک مولار، تا ۵/۵ افزایش داده شد. در این pH پروتئین دارای بار منفی شده و کیتوسان (با 7-6=pl) نیز دارای بار مثبت می باشد و برخورد های الکتروستاتیکی بین BSA و کیتوسان افزایش یافته و در نتیجه راندمان انباشت BSA نیز افزایش می یابد. سپس با اضافه کردن ۱۲ میلی لیتر محلول TPP در آب ( 0/451mg/ml) به ۳۰ میلی لیتر محلول کیتوسان در اسید استیک ( mg/ml 1/7 ) حاوی پروتئین مدل mg/ml ) BSA 0/2) تحت همزدن مکانیکی آرام، در دمای اتاق و به مدت یک ساعت به منظور به دست آوردن ماکزیمم درصد انباشت پروتئین، صورت پذیرفت.به منظور تهیه ی نانوذرات کیتوسان انباشته شده با فاکتور رشد 1-TGF مشابه پروتوکل به دست آمده برای BSA عمل کرده، با این تفاوت که به دلیل بالا بودن اpl فاکتور رشد TGF-B1 )8/83) این پروتئین به مقدار به محلول TPP که دارای PH ای نزدیک و بالاتر (حدود ۱۰) از اpl فاکتور رشد TCiF-Bl می باشد اضافه گشته و البته نیازی به اضافه کردن NaOH نیز نمی باشد.

3-1-مواد 84

3-2-دستگاه ها 85

3-2-1-سیستم الکتروریسی  85

3-2-2-میکروسکوپ الکترونی روشی SEMا   86

3-2-3-میکروسکوپ الکترونی روبشی گسیل میدانی FESEMا      87

3-2-4-میکروسکوپ عبور الکترونی باوضوح بالا 88

3-2-5-دستگاه پراکندگی دینامیک نور DLSا 89

3-3-دستگاه تست کششی اینسترون 90

3-3-روشها  92

3-3-1-تهیه نانوذرات کیتوسان انباشته شده با پروتئین مدل BSAا  92

3-3-2-اولتراسانتریفیوژ محلول حاوی نانوذرات کیتوسان 93

3-3-3-تهیه محلول های الکتروریسی 93

3-3-4-الکتروریسی محلول ها 94

3-3-5-فرایند پلاسما برروی سطح نانوفیبر وپوشش دهی سطح نانوفیبر با ژلاتین 94

3-3-6-بررسی راندمان انباشت پروتئین درنانوذرات ورفتار رهایش پروتئین مدل ازنانوفیبر حاوی نانو ذرات کیتوسان 95

3-3-7-آنالیز MTTا  96

3-3-8-بررسی مورفولوژی وپراکندگی سلول ها برروی داربست با استفاده از آنالیز SEMا 97

3-3-9-سنجش بیولوژیکی فعالیت فاکتور رشد TGF-B1 رهایش یافته 97

3-3-10-آنالیز تخریب حرارتی TGAا   98

دو نگرش عمده در مهندسی بافت

دو نگرش عمده در مهندسی بافت

فصل چهارم:نتایج وبحث

4-2- مورفولوژی و آرایش نانوفیبرهای به کار رفته در داربست های تک لایه و سه لایه:

 مورفولوژی نانوفیبرهای پلی کاپرولاکتون حاوی نانوذرات کیتوسان به دست آمده از آنالیز SEM نیز در شکل 3-4 نمایش داده شده است که آرایش فیبرها تقریبا موازی و قطر متوسطی نزدیک به دو میکرومتر را نشان می دهد. که قطری مشابه به کار انجام شده توسط Yazhou Wang و همکاران را نشان می دهد.همچنین در شکل 4-4 تصویر به دست آمده از نانوفیبر ,PCL را می توان دید. از مقایسه ی شکل ۴-۳ نانوذرات، منظم تر و دارای قطر کمتری حدود ۷۰۰ نانومتر می باشد.گرچه سورفکتانت 80-TWeen الکتروریسی همزمان دو فاز آبی (نانوذرات کیتوسان) و آلی (پلی کاپرولاکتون) را از طریق تهیه ی یک امولسیون پایدار ممکن می سازد ولی استفاده از آن به همراه کیتو سان هدایت محلول را به مقدار زیادی افزایش داده که همین امر علت اصلی شاخه شاخه شدن آرایش نانوفیبر های پلی کاپرولاکتون حاوی نانوذرات کیتوسان می باشد.

4-3- توزیع نانوذرات کیتوسان در نانوفیبر PCL

تصویر به دست آمده از آنالیز HRTEM نانوفیبر PCL حاوی نانوذرات کیتوسان در شکل ۴-۸ قابل مشاهده است. همانطوری که در شکل ۴-۸ d مشاهده می کنید.زمانی که سوسپانسیون نانوذرات کیتوسان و پلی کاپرولاکتون از مجرای سوزن عبور کرده و به سرعت جت های خمیده و پراکنده شده را تشکیل ملتی دهد، فاز پراکنده (نانو ذرات کیتو سان) به دلیل اثر کششی در راستای جریان در طی اسپری شدن در جریان هوا، تمایل به انباشت در مرکز جت مایع را آن باشد. از طرف دیگر می توان گفت نانوذرات کیتوسان (فاز آبی) به منظور رسیدن به حداقل آنتالپی سطح در مجاورت محور مرکزی نانوفیبر تجمع پیدا کرده و جداره ی بیرونی را PCL (فاز آلی) تشکیل می دهغد. و البته کمک سورفکتانت 80-as Tween ليس بـصبية کاهش آنتالپی سطح s افزایش سطح مخصوص بین دو فاز می شود؛ نانوذرات کیتوسان توانسته به طور مؤثر در محلول پلی  اپرولاکتون پراکنده شده و در نهایت سوسپانسیون کامپوزیتی نانوذرات و PCL تهیه می شود. به نظر می رسد همانطوری که در شکل ۴-b۸ مشاهده می کنید به دلیل ناپایدار بودن امولسیون نانوذرات کيتوسان + سور فکتانات tween + پلی کاپرولاکتونآرایش نانوذرات در نانوفیبر همگن نبوده و در بسیاری از نقاط نانوذرات به سطح نانوفیبر نیز رسیده اند.

4-1-مورفولوژی وتوزیع سایز نانوذرات کیتوسان انباشته شده با پروتئین 100

4-2-مورفولوژی وآرایش نانوفیبرهای به کاررفته در داربست تک لایه وسه لایه 102

4-3-تویع نانوذرات کیتوسان درنانوفیبر PCLا 110

4-4-خواص کششی داربست های تک لایه وسه لایه 111

4-5-راندمان انباشت ماکزیمم پروتئین درنانوذرات کیتوسان وپروفایل رهایش ازداربست های نانوفیبری تک لایه وچند لایه ی حاوی نانوذرات کیتوسان   116

4-6-آنالیز زیست سازگاری MTTا  118

4-7-بررسی مورفولوژی و پراکندگی سلول ها برروی داربست 120

4-8-نتایج سنجش بیولوژیکی TGF-B1 رهایش یافته از داربست 122

4-9-نتایج آنالیز تخریب حرارتی TGAا 123

ساختار سه لایه ای دیواره مثانه

ساختار سه لایه ای دیواره مثانه

فصل پنجم:نتیجه گیری وپیشنهادات

با توجه به کاربرد های فراوان رهایش پایدار فاکتور رشد در داربست های زیست فعالی و از طرفی اهمیت حفظ فعالیت پروتئین ها، چه در فاز آزمایشگاهی و چه در داخل بدن، طراحی این سیستم از اهمیت قابل ملاحظه ای به ویژه در مهندسی بافت مثانه برخوردار است. رهایش پایدار پروتئین چه در القاء رشد و تمایز سلول ها و چه در رگزایی و افزایش بازسازی بافت می تواند مورد استفاده قرار گیرد. اهمیت سیستم چند لایه از آن جهت می باشد که می توان با تغییر ضخامت لایه های بیرونی پروفایل رهایش مطلوب را به دست آورد. اگرچه که داربست تک لایه نیز به دلیل زیست شبیه سازی هندسی بهتر و سایز تخلخل بیشتر حائز اهمیت است. به منظور بهبود خواص مکانیکی داربست ها چنانچه دستگاه الکتروریسی طراحی شود که بتواند فیبرها را به صورت لایه لایه عمود بر هم بریسد این امکان را به ما می دهد که با ادغام خواص جهت فیبر و عمود بر جهت آن، خواص مکانیکی داربست را تا حد امکان به بافت مثانه نزدیک کنیم. در نهایت با سنجش بیولوژیکی فعالیت فاکتور رشد رهایش یافته از داربست های نانوفیبری هیبریدی PCL حاوی نانوذرات کیتوسان و PLLA، این مدعی که پروتئین به دلیل قرار گرفتن در بالک هیدروژل کیتوسان از معرض آسیب هایی از سوی حلال سمی و یا میدان الکتریکی اعمال شده در دستگاه الکتروریسی، در امان می ماند، به اثبات رسید. و این نشان می دهد که داربست های تهیه شده به معنای واقعی زیست فعال بوده اگرچه که به دلیل کوتاه بودن نیمه عمر TGF در محیط بافری با دمای ۳۷ درجه و عدم امکان استفاده از غلظت های بالای فاکتور رشد به دلایلی اقتصادی، عملا امکان اندازه گیری رهایش طولانی مدتTGF-B از داربست وجود نداشت. با این وجود همانطوری که سنجش بیولوژیکی فعالیت TGF-Bl نیز نشان داد، از آنجایی که سلول به صورت دینامیک و لحظه ای اثر سیگنالی فاکتور رشد رهایش یافته را از طریق رسپتور های سطح غشاء دریافت می کند، کوتاه بودن نیمه عمر TGF-Bتأثیری بر میزان فعالیت آن بر سلول نمی گذارد. در کارهای آینده می توان با بررسی اثر تمایزی دو داربست زیست فعال تک لایه و سه لایه، داربست بهینه به منظور مهندسی بافت مثانه پیدا کرد. مزیت دیگر این سیستم، استفاده از آن به منظور رهایش همزمان چندین پروتئین می باشد. بدیهی است از آنجایی که در مهندسی بافت نیاز مبرمی به افزایش رگزایی و بازسازی بافت در فاز in vivo نیز میباشد می توان با انباشته کردن همزمان چندین پروتئین علاوه بر پروتئین تمایزی در نانوذرات مجزا، به این هدف نیز دست یافت. اندازه گیری رهایش پروتئین در فاز in vivo و همچنین به کارگیری این سیستم جهت Gene delivery از جمله کارهاییست که می توان در آینده انجام داد.

مراجع   129

شکل شماتیک دستگاه الکتروریسی

شکل شماتیک دستگاه الکتروریسی

فهرست جداول

2-1-ترکیبات موجود در ماتریکس خارج سلولی دیواره ی مثانه   34

2-2-خصوصیات مکانیکی ECM مثانه انسان 39

2-3-چگونگی تاثیر پارامترهای طراحی 50

2-4-مقایسه روشهای اصلاح سطح نانوفیبری 59

3-1-لیست مواد مصرفی به همراه شرکت و کشور سازنده 84

4-1-خواص کششی داربست های Mono وداربست سه لایه Multi درراستای جهت فیبر وعمود برجهت فیبر ومقایسه ی آن با مثانه طبیعی انسان   114

عوامل بیوشیمیایی موثربر تمایز

عوامل بیوشیمیایی موثربر تمایز

فهرست اشکال

شکل ۱-۱: دو نگرش عمده در مهندسی بافت    4

شکل ۱-۲: نانوتکنولوژی و مهندسی بافت      7

شکل ۲-۱: ساختار سه لایه ای دیواره ی مثانه        36

شکل ۲-۲: آرایش موازی فیبر های کلاژن و الاستین در لایه ی ماهیچه ای صاف. فیبر های با قطر بزرگتر کلاژن بوده و فیبر های با قطر کوچک تر الاستین می باشد        38

شکل ۲-۳: آرایش رندوم فیبر های کلاژن و الاستین در لایه ی Connective tissue ا    38

شکل ۲-۴: تأثیر مدول الاستیسیته ی داربست بر تمایز سلول بنیادی   40

شکل ۲-۵: عوامل بیوشیمیایی مؤثر بر تمایز    41

شکل ۲-۶: شکل شماتیک دستگاه الکتروریسی     44

 شکل ۲-۷: آرایش مختلف فیبر های به دست آمده با استفاده از الکتروریسی       48

شکل ۲-۸ز دو نوع کلکتور معمول مورد استفاده به منظور به دست آوردن آرایش موازی فیبرها     49

شکل ۲-۹: نحوه ی تأثیر ولتاژ بر مخروط خروجی از سرنگ       52

شکل ۲-۱۰: نحوه ی تأثیر دور کلکتور بر آرایش فیبرها    53

شکل ۲-۱۱: فرایند پلاسما و پوشش دهی فیزیکی مولکول های فعال بر روی سطح نانوفیبر     54

شکل ۲-۱۲: روش شیمیایی مرطوب     55

شکل ۲-۱۳: روش پلیمریزاسیون پیوند سطحی    57

شکل ۲-۱۴: الکترواسپینینگ همزمان عوامل زیست فعال و پلیمر ها     58

شکل ۲-۱۵: تکنیک های معمول مورد استفاده  برای ساخت داربست نانوفیبری الکتروریسی شده ی زیست

فعال          66

شکل ۲-۱۶: سیستم نوین و برتر داربست های زیست فعال    70

شکل ۲-۱۷: طراحی نهایی داربست نانوفیبری هیبریدی به منظور مهندسی بافت مثانه     71

شکل ۲-۱۸: داربست چند لایه ی نانوفیبری      73

شکل ۳-۱: دستگاه نیمه صنعتی الکتروریسی ولتاژ بالای مورد استفاده در این پروژه       86

شکل ۳-۲: میکروسکوپ الکترونی روبشی ( SEM) مدل XL30 ا     87

شکل ۳-۳: میکروسکوپ الکترونی روبشی گسیل میدانی         88

شکل ۳-۴: میکروسکوپ عبور الکترونی با وضوح بالا      89

شکل ۳-۵: دستگاه پراکندگی دینامیک نور    90

شکل ۳-۶: دستگاه اینسترون     91

شکل 4-1 : توزیع سایز نانوذرات کیتوسان به دست آمده از آنالیز     100

شکل ۴-2: مورفولوژی نانوذرات کیتوسان به دست آمده از آنالیز        101

شکل ۴- ۳: مورفولوژی نانوفیبر پلی کاپرولاکتون حاوی نانوذرات کیتوسان به دست آمده از آنالیز SEMا     102

شکل ۴- ۴: مورفولوژی نانو فیبر PCLا        104

شکل ۴- ۵: مورفولوژی نانوفیبر PLLA ا     106

شکل ۴-۶ : مورفولوژی نانوفیبر هیبرید PCL حاوی نانوذرات کیتوسان       108

شکل ۴ – ۷: مورفولوژی نانوفیبر هیبرید         109

شکل ۴-۸ : HRTEM نانوفیبر PCL حاوی نانوذرات کیتوسان   111

شکل 4-12: نتایج جذب به دست آمده از آنالیز MTT در طول موج ۵۴۰ نانومتر       118

شکل ۴-۱۳: مورفولوژی سلولی بنیادی مزانشیمی پس از ۳ روز کشت بر روی داربست ها             121

شکل ۴ – ۱۴: مورفولوژی سلولی بنیادی مزاتشیمی پس از ۵ روز کشت بر روی داربست ها       122

شکل ۴- ۱۵ : بیان ژن 10-L  در حضور داربست نسبت به حالت کنترل بدون داربست            123

شکل ۴-۱۶: پروفایل درصد کاهش جرم و قرینه گرادیان تغییرات جرم نسبت به دما به دست آمده از آنالیز TGA (در اتمسفر نیتروژن) داربست نانوفیبری هیبریدی-کامپوزیتی PCL-PLLA حاوی نانوذرات کیتوسان انباشته شده با پروتئین      123

نانوتکنولوژی ومهندسی بافت

نانوتکنولوژی ومهندسی بافت


Abstract

In this project, a novel system of bioactive electrospun scaffold for bladder tissue engineering. has been investigated to control in vitro cell differentiation, and utilize in in vivo vascularization and tissue formation. This method doesn’t have custom bioactive scaffolds problems such as, protein instability, technical complexity and difficulties in accurate kinetics prediction. First of all, protein loaded chitosan nanoparticles based on ionic gelation interaction between chitosan and Sodium tripolyphosphate were prepared. Maximum protein loading efficiency (80% for BSA & 99% for TGF-beta1) in chitosan nanoparticles was obtained at mean diameter of 51 nm. Moreover polycaprolactone electrospun fibers containing protein loaded chitosan nanoparticles, with parallel arrangement and mean diameter of 2 micrometer were prepared. In order to obtain desired mechanical properties and, tissue regeneration with enough elasticity for expansion and contraction, we made scaffolds biomimetic to bladder tissue by use of PCLiNP-PLLA hybrid nanofibers. This scaffold showed a fiber diameter ratio similar to the collagenelastin fiber ratio in bladder extracellular matrix. A novel multi-layered structure of nanofibers synthesized in our research, was used to get a sustained release of the protein. The MTT assay showed, Gelatin coated PCL-PLLA, Gelatin coated Mono.PCLNP-PLLA and, Gelatin coated MultiPCLNP-PLLA nanofiber scaffolds have enough adherence sites for Mesenchymal stem cell adhesion, migration and proliferation. Finally, bioassay of TGF-B released from scaffold, indicated the toxic solvents and the high voltage electric field have not effect on the growth factor bioactivity.

Keywords: bladder, tissue engineering, nanofibers, nanoparticles, growth factor


تعداد صفحات فایل : 135

مقطع : کارشناسی ارشد

بلافاصله بعد از پرداخت به ایمیلی که در مرحله بعد وارد میکنید ارسال میشود.


فایل pdf غیر قابل ویرایش

خرید فایل pdf و سفارش فایل word

قبل از خرید فایل می توانید با پشتبانی سایت مشورت کنید