انتخاب صفحه

 مقدمه

بیوتکنولوژی دانشی است که در رابطه با استفاده از موجودات و یا متابولیت های آنها جهت تولید فرآورده های مختلف دارویی ، غذایی ، شیمیایی و غیره در مقیاس صنعتی بحت می کند. روند تکاملی بیو تکنولوژی در طی هزاران سال شکل گرفته و نهایتا به علمی تبدیل شد که با جهت گیری کاربردی میکروبیولوژی و بیو شیمیایی ، ارتباط نزدیکی با مهندسی شیمی ایجاد نموده است ( 48 ).بین انسانها و میکرو ارگانیسمها ، از ابتدا ارتباط حیاتی بسیار نزدیکی وجود داشته که این ارتباط می تواند مضر و یا مفید باشد. پس از آنکه رابرت کخ در سال 1880 برای اولین بار کشت خالص باکتری ها را به دست آورد ، توجه زیادی به عوامل بیماری زا شد و مطالعات بعدی نشان داد که با وجود این که برخی میکروبها عامل بیماری در انسان ، حیوان و گیاه هستند ، عده زیاد دیگری کاربرد صنعتی داشته و در تولید مواد غذایی، داروها ، آنزیم ها ، اسید های آمینه و غیره نقش دارند(52).در دهه 1940 و 1950 که آنتی بیوتیکهای اولیه نظیر پنی سیلین کاربرد بالینی پیدا کرده و به عنوان داروهای ایجازگر شناخته شده بودند ، با از بین بردن بسیاری از باکتری ها عامل وخیم ترین بیماری های عفونی انسان ، جان میلیونها تن حفظ شد. اما مدتی پس از کشف آنتی بیوتیک ها ، به دلایل متعدد، از جمله استفاده نادرست و یا بیش از حد از آنها ، مثلا استفاده تنها جهت فربه کردن دام ، سویه های میکرو ارگانیسم در مقابل آنتی بیوتیک ها مقاوم شدند ، بطوریکه امروزه مجددا بیماری های عفونی ناشی از میکرو ارگانیسم ها تهدیدی جدی برای سلامتی در دنیا محسوب شده و هزینه های بسیار زیادی برای درمان آنها مصرف می شود.طی سالهای 1925 تا 1965 استفاده از میکروبها در صنایع دارویی به صورت یک تحول اساسی زمینه را برای بکارگیری میکروارگانیسمها در تولید داروها و بویژه آنتی بیوتیکها فراهم ساخت و با گذشت زمان این روند تکامل یافت به طوری که امروزه بیو تکنولوژی در حال ورود به مرحله جدیدی است و به عنوان یک علم در عصر پیدایش و ساخت آنتی بیوتیکها توسعه چشم گیری داشته و در حال حاضر تولید انبوه فرآورده های میکروبی نظیر  آنتی بیو تیک ها  به صنعت چند میلیارد دلاری مبدل شده و از نقطه نظر اقتصادی ، آنتی بیوتیکها مهم ترین فراورده های صنعتی دنیای میکروبها محسوب می شوند(12).  بدین ترتیب بالا بردن راندمان تولید و اقتصادی تر کردن فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها جز اهداف ضروری است که با تلاش متخصصین در شاخه های مختلف علوم نظیر میکرو بیو لوژی ، بیو شیمی، مهندسی شیمی،بیوتکنولوژی و غیره می توان به آن دست یافت. در صنعت بیوتکنولوژی برای تولید محصولاتی نظیر آنتی بیوتیک ها دو بخش عمده وجود دارد :1- عملیات بالا دستی(Up stream ) : که شامل دو بخش توسعه سویه و توسعه محیط کشت و تخمیر است و در این بخش ها نقش مهندسی شیمی و میکروبیولوژیست حائز اهمیت است. هدف از بخش توسعه سویه ، شناخت، تهیه و تثبیت میکروارگانیسم مولد محصول و هدف از بخش توسعه محیط کشت ، بهینه سازی محیط کشت از نظر میزان و نوع مواد، شرایط تولید و اقتصادی تر نمودن فرآیند می باشد.2- عملیات پایین دستی( D. stream) : در این بخش که در واقع فرآوری پس از تخمیر است، نقش مهندسان در جهت دهی فرآیند تخمیر به سمت نتایج بسیار مهم می باشد. هدف از این مرحله، جداسازی و خالص سازی محصول می باشد. ( 17)

فهرست مطالب  

فارسی……………………………………………………………………………………………………………………..1

مقدمه………………………………………………………………………………………………………………………….2

برای دانلود رایگان قسمت های بیشتراز فایل به انتهای مطلب مراجعه کنید

فصل اول:کلیات

در این پژوهش سعی بر این شده تا با استفاده از یک منبع نیتروژنی بومی ( ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا ) بتوانیم تولید صنعتی آنتی بیوتیک اریترومایسین را به روش فرمانتاسیون میکروبی بهینه سازی کنیم . امروزه در صنعت تولید این آنتی بیوتیک از کنجاله سویا استفاده می شود. اما در این پژوهش مشخص شد که استفاده از ترکیب این دو منبع نیتروژنی علاوه بر بالا بردن بازده محصول ، تولید اریترومایسین را از نظر اقتصادی مقرون به صرفه تر می کند. منبع نیتروژنی پیشنهاد شده با نسبت های مختلف به محیط کشت تخمیر باکتری Saccharopolyspora erythraea  اضافه شد. در طول فرایند تغییرات مورفولوژیک باکتری ، pH ، درصد وزن تر بیومس تولیدی از روز چهارم به صورت یک درمیان اندازه گیری و میزان اریترومایسین تولیدی به روش اسپکتروفتومتری سنجیده شد.

1-2)بیان مسأله

امروزه بیماریهای عفونی ناشی از میکروارگانیسم ها تهدیدی جدی برای سلامتی در دنیا محسوب میشود و هزینه های زیادی برای درمان آنها اختصاص داده می شود. به همین علت نیاز به یافتن آنتی بیوتیکهای جدید و افزایش کارایی آنتی بیوتیکهای شناخته شده، بالا بردن بازده تولید و اقتصادی تر کردن فرایندهای تولید بسیار مهم می باشد. آنتی بیوتیکها مهمترین فراورده دنیای میکروبها هستند و جز پرمصرفترین داروها می باشند. کشف پنی سیلین توسط فلمینگ در سال 1929 را میتوان آغاز عصر آنتی بیوتیکها دانست. در تعریف کلی آنتی بیوتیک به ماده شیمیایی گفته میشود که توسط میکروارگانیسم تولید شده و میتواند بصورت انتخابی رشد سایر میکرو ارگانیسمها و یا تومورهای بدخیم را متوقف کند. امروزه این داروها در دامپزشکی هم کاربرد دارد و به عنوان ماده افزودنی در غذای حیوانات به کار می رود و همچنین به عنوان مواد حافظ گیاهان و غذاها نیز به کار میروند. بر اساس پیش بینی های انجام شده میزان مصرف این دارو در سال 2013 بیش از 40 میلیارد دلار میباشد و این میزان رو به افزایش خواهد بود. پس میتوان گفت که آنتی بیوتیکها اهمیت اقتصادی زیادی دارند. یکی از آنتی بیوتیکهای مهم و پرمصرف مورد استفاده اریترومایسین است که در درمان طیف وسیعی از بیماریها کاربرد دارد. این دارو جز ماکرولیدهاست و فرمول شیمیایی آنH H 67 NO13 و وزن ملکولی آن 94/733 گرم بر مول است.این آنتی بیوتیک با اتصال به زیر واحد 50 S ریبوزوم باکتریایی ممانعت کننده سنتز پروتئین هستند. لازم به ذکر است که پروتئینهای L15 و L16 در اتصال اریترومایسین به زیر واحد ریبوزوم نقش دارند. در پیکره اریترومایسین یک حلقه لاکتونی بزرگ وجود دارد که 13 کربنی است. همچنین یک قند آمین دار به نام دزز آمین دارد که با پیوند گلیکوزیدی به هسته لاکتونی متصل است. اریترومایسین یک ترکیب کریستالی بی رنگ است که در آب کم محلول است ولی در بسیاری از حلالهای آلی مانند استن به خوبی قابل حل است. اریترومایسین یک باز ضعیف است و طعم تلخی دارد. این دارو باکتریو استاتیک است ولی در غلظتهای بالا باکتریوساید میشود. این دارو برای درمان برنشیت، زخمهای عفونی،دیفتری، گلودرد،تب مخملک و … موثر است. بازار مصرف این دارو اکنون دارای رشد 6 تا 8 درصد افزایش تولید در سال میباشد. آمار مصرف آن در ایران در سال 89 ، 2/11 میلیارد تومان گزارش شده است.

اریترومایسین علیه ارگانیسمهای گرم مثبت نظیر استرپتوکوک، استافیلوکوک، پنوموکوک و ارگانیسمهای گرم منفی مثل نایسریا و بردتلا پرتوسیس موثر است.این دارو جایگزین مناسبی برای پنی سیلین در افراد آلرژیک نسبت به پنی سیلین است.  با توجه به این نکته تلاش برای بهینه سازی و کاهش قیمت روند تولید این دارو با اهمیت است و در این پژوهش سعی بر این شده که راه حلی برای کاهش قیمت و بومی سازی تولید این دارو پیدا شود. به طور کلی فرآیند تولید آنتی بیوتیکها شامل 5 مرحله اصلی است .آنچه در این پژوهش بیشتر مدنظر است ، تغییر در ترکیبات محیط کشت به کار رفته در مرحله تخمیر است. عمل تخمیر در فرمانتور یا بیوراکتور انجام میشود. یک فرایند تخمیری به روشهای غیر مداوم، مداوم و نیمه بسته انجام میشود.عواملی در طی یک فرایند تخمیر بیشترین اهمیت را دارند و محققان با تغییر در شرایط آنها سعی در بالا بردن بازده و کاهش هزینه های تولید دارند. این عوامل عبارتند از : ترکیبات محیط کشت، درجه حرارت، هوادهی، pH ، همزنی، دی اکسید کربن، کف، استرلیزه بودن محیط و ظروف.در تهیه محیط کشت، تاکید زیادی روی کنترل کردن بهای مواد خام میشود. زیرا این مواد میتوانند تاثیر مهمی روی محصول نهایی بگذارند. از جمله معیارهای دیگر برای انتخاب مواد خام :

  • حداکثر بازدهی محصول به ازای هر گرم سوبسترا فراهم کند.
  • حداکثر غلظت محصول را فراهم کند و اجازه حداکثر سرعت تولید را بدهد.
  • ارزان باشد و در طول سال با کیفیت یکسان و به راحتی در دسترس باشد.
  • حداقل مشکلات را در جنبه های دیگر فرایند مخصوصا هوادهی و هم زدن و خالص سازی و استخراج و…. فراهم کند.

از جمله منابع گوناگونی که در محیط کشت تخمیر مورد استفاده قرار می گیرند منابع کربنی مثل عصاره مالت، نشاسته، دکسترین، روغن سویا  و منابع نیتروژنی هستند. نیتروژن غیر آلی بصورت سولفات آمونیوم به کار می رود. منابع نیتروژن آلی مثل اوره و پروتئین ها می باشد. بهینه سازی ترکیبات محیط کشت یکی از روشهای کارامد و عوامل موثر برای افزایش تولید فراورده های بیوتکنولوژیک می باشد و در این راه منابع نیتروژنی سهم زیادی دارند. کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان دو منبع نیتروژنی اصلی دارای یکسری ویژگی هایی هستند که باعث گردیده استفاده از آنها در صنعت تولید آنتی بیوتیک مقرون به صرفه باشد و موجب خودکفایی کشور در این زمینه میشوند. برخی از این ویژگی ها عبارتند از :

  • ترکیب شیمیایی مناسب برای فراهم کردن منبع نیتروژنی فرمولاسیون محیط کشت تخمیر
  • تولید فراوان سویا و کلزا در داخل کشور ( بومی سازی )
  • ارزان و در دسترس بودن

1-3)ضروریت انجام تحقیق

از آنجا که اریترومایسین از جمله آنتی بیوتیک های مهم ، وسیع الطیف و پر کاربرد در کشور می باشد، لذا بومی کردن و مقرون به صرفه کردن فرآیند تولید آن ، از ضروریات انجام تحقیق می باشد.

1-1) طرح موضوع……………………………………………………………………………………………………………..5

1-2) بیان مسأله……………………………………………………………………………………………………………..5

1-3) ضرورت انجام تحقیق……………………………………………………………………………………………………8

1-4) هدف پژوهش……………………………………………………………………………………………………………8

1-5) سؤالات و فرضیه ها…………………………………………………………………………………………………….8

1-6) تعریف آنتی بیوتیک……………………………………………………………………………………………………10

1-7) تاریخچه آنتی بیوتیک…………………………………………………………………………………………………11

1-8) اهمیت اقتصادی آنتی بیوتیک ها…………………………………………………………………………………..12

1-9) گروه های تولید کننده آنتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………13

1-10) معرفی و بیان ویژگی های Saccharopolyspora erythraea ..ا……………………………………………….14

1-11) طبقه بندی آنتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………….15

1-11-1) طبقه بندی بر اساس منبع بیولوژیک…………………………………………………………………………15

1-11-2) طبقه بندی بر اساس ساختار شیمیایی…………………………………………………………………….16

1-11-3) طبقه بندی بر اساس مکانیسم عمل………………………………………………………………………17

1-12) مواردکاربرد آنتی بیوتیک ها……………………………………………………………………………………..24

1-13) ماکرولیدها……………………………………………………………………………………………………….27

1-14) اریترومایسین، ساختمان و ویژگی ها…………………………………………………………………………30

1-15) تاریخچه تولید اریترومایسین…………………………………………………………………………………….31

1-16) نام ها و فرمول شیمیایی اریترومایسین……………………………………………………………………….32

1-17) مکانیسم عمل اریترومایسین…………………………………………………………………………………….32

1-18) فعالیت ضد میکروبی اریترومایسین……………………………………………………………………………..33

1-19) فارماکوکینتیک……………………………………………………………………………………………………..34

1-20) مصارف بالینی اریترومایسین……………………………………………………………………………………..34

1-21) عوارض جانبی اریترومایسین……………………………………………………………………………………..35

1-22) اشکال دارویی اریترومایسین……………………………………………………………………………………..36

1-23) آنتی بیوتیک های مشتق شده از اریترومایسین………………………………………………………………..36

1-24) مراحل کلیدی فرآیند تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین…………………………………………….38

1-24-1) حفظ و نگهداری کشت فعال…………………………………………………………………………………….39

1-24-2) تهیه مایه تلقیح به فرم سوسپانسیون اسپوری و توسعه آن………………………………………………..44

1-24-3) مرحله پیش کشت یا بذردهی یا seeding ……..ا……………………………………………………………45

1-24-4) مرحله تخمیر یا Fermentation …ا……………………………………………………………………………..47

1-24-4-1) تکنولوژی تخمیر آنتی بیوتیک…………………………………………………………………………………48

1-24-4-1-1) تخمیر شیک فلاسک………………………………………………………………………………………48

1-24-4-1-2) فرمانتورهای همزن دار……………………………………………………………………………………49

1-24-4-2) بررسی تأثیر عوامل مختلف برروی تخمیر و تولید آنتی بیوتیک ها از جمله اریترومایسین…………..50

1-24-4-2-1) تأثیر محیط کشت تخمیر و ترکیبات مورد استفاده در آن………………………………………………50

1-24-4-2-1-1) منابع کربنی…………………………………………………………………………………………51

1-24-4-2-1-2) منابع نیتروژنی…………………………………………………………………………………………….55

1-24-4-2-1-3) آب…………………………………………………………………………………………………………..57

1-24-4-2-1-4) مواد معدنی……………………………………………………………………………………………….57

1-24-4-2-1-5) مواد مغذی پیچیده………………………………………………………………………………………59

1-24-4-2-1-6) ویتامین ها و فاکتورهای رشد……………………………………………………………………….61

1-24-4-2-1-7) پیش ماده ها……………………………………………………………………………………………61

1-24-4-2-1-8) القا کننده ها و تحریک کننده ها…………………………………………………………………….61

1-24-4-2-2) تأثیر pH….ا………………………………………………………………………………………………..62

1-24-4-2-3) تأثیر دما…………………………………………………………………………………………………….64

1-24-4-2-4) تأثیر هوادهی……………………………………………………………………………………………..67

1-24-4-2-5) تأثیر هم زدن………………………………………………………………………………………………68

1-24-4-2-6) تأثیر دی اکسید کربن…………………………………………………………………………………..71

1-24-4-2-7) تأثیر کف…………………………………………………………………………………………………71

1-24-4-2-8) تأثیر استریلیزاسیون……………………………………………………………………………………..73

1-24-4-2-9) تأثیر ویسکوزیته…………………………………………………………………………………………..74

1-24-4-2-10) تأثیراریترومایسین تولید شده…………………………………………………………………………..76

1-24-5) برداشت و خالص سازی محصول……………………………………………………………………………..77

1-25) سویا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی……………………………………………………..79

1-25-1) علل انتخاب سویا و توسعه کشت آن…………………………………………………………………….79

1-25-2) تاریخچه سویا…………………………………………………………………………………………………80

1-25-3) تولید و مصرف جهانی سویا……………………………………………………………………………………81

1-25-4) سویا در ایران…………………………………………………………………………………………………..82

1-25-5) اجزای ترکیبی سویا………………………………………………………………………………………….82

1-25-6) کنجاله سویا………………………………………………………………………………………………….83

1-26) کلزا و علت انتخاب آن به عنوان منبع نیتروژنی بومی……………………………………………………….83

1-26-1) علل عمده انتخاب کلزا و توسعه کشت آن…………………………………………………………………84

1-26-2) تاریخچه کلزا……………………………………………………………………………………………………85

1-26-3) تولید جهانی کلزا……………………………………………………………………………………………..86

1-26-4) اجزای ترکیبی کلزا……………………………………………………………………………………………86

فصل دوم : مروری بر متون گذشته

در زمینه بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در فرمولاسیون محیط کشت تخمیر و تولید اریترومایسین تاکنون تحقیقی صورت نگرفته که در این پژوهش به آن پرداخته میشود. اما در زمینه تولید اریترومایسین و اثر عوامل مختلف در میزان تولید آن پژوهش هایی انجام گرفته است که برخی از آنها عبارتند از:

  • پایان نامه دکتری با عنوان اثر 18روغن مختلف در رشد Saccharopolyspora  erythraea  و تولید اریترومایسین که در سال 1381 توسط جواد حامدی به راهنمایی فریدون ملک زاده در دانشگاه علوم دانشگاه تهران انجام شد. در این پژوهش اثر 18 روغن مختلف و اسیدهای چرب مختلف و همچنین یک ضد کف سیلیکونی در رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین بررسی گردید.

نتیجه حاصل بدین صورت بود که تمامی روغن ها موجب افزایش میزان تولید اریترومایسین شدند. رده بندی روغن ها به ترتیب نزولی عبارتست از : روغن هسته آلبالو، روغن دانه هندوانه، روغن دانه خربزه، روغن پسته ، کلزا ، ذرت ، روغن آفتابگردان ، کنجد، روغن خوک، زیتون، روغن هسته انگور ، سویا ، روغن پنبه دانه ، روغن فندق ، نارگیل ، کوسه ماهی و روغن گلرنگ. در غلظت بهینه روغن در حین فرآیند مرتبه بعضی از این روغن ها از نظر تولید ارترومایسین تغییر کرده است .

  • پایان نامه کارشناسی ارشد با عنوان بررسی ارتباط مورفولوژی، رئولوژی و تولید اریترومایسین با استفاده از همان باکتری که در سال 1382 توسط حسین قجاوند به راهنمایی محمد حیدریان، بابک بنکدارپور و جواد حامدی در دانشکده مهندسی شیمی دانشگاه صنعتی امیر کبیر انجام شد. در این پژوهش تغییرات و ارتباط متقابل بین مورفولوژی میسلیومی و خواص رئولوژیکی مایعات تخمیری باکتری Saccharopolyspora erythraea در کشت های شیک فلاسک بررسی شده است.

نتایج حاصل بدین ترتیب بوده است که در غلظت های مایه تلقیح اسپوری بالاتر از 105 اسپور در میلی لیتر مورفولوژی بیشتر به شکل میسلیومی و کلامپ می باشد و جمعیت کلامپ ها خیلی بیشتر از میسلیوم هاست. در غلظت های مایه تلقیح مساوی یا پایین تر از 105 اسپور در میلی لیتر مورفولوژی بیشتر به شکل پلتی است. در غلظت های بالاتر از 109 اسپور در میلی لیتر مایه تلقیح ، اریترومایسین بیشتری تولید کرده است و همچنین مورفولوژی میسلیومی و کلامپی برای تولید اریترومایسین از مورفولوژی پلتی بهتر می باشند.

  • پایان نامه دکتری با عنوان بررسی اثر منابع کربن و نیتروژن محیط پیش کشت در رشد همان Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین که در سال 1384 توسط مهسا رستم زا ، به راهنمایی اشرف السادات نوحی ، جواد حامدی و همکاران دردانشکده علوم دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات انجام شد. در این پژوهش اثر منابع کربنی شامل نشاسته، دکسترین ، گلوکز ، گلیسرول ، ملاس چغندر قند و منابع نیتروژنی بومی شامل آرد سویا ، شیرابه ذرت ، نیترات آمونیوم و سولفات آمونیوم در محیط کشت بذردهی و تولید اریترومایسین بررسی شد. نتایج حاصل بدین صورت بوده است که میزان تولید اریترومایسین در محیط های بذردهی حاوی غلظت های 15-0 گرم در لیتر دکسترین ، 5-0گرم در لیتر نشاسته ، 15-0 گرم در لیتر ملاس چغندر قند و 20-0 گرم در لیتر گلیسرول با محیط شاهد یکسان بوده است.

همچنین میزان تولید اریترومایسین از تلقیح محیط های بذر دهی حاوی غلظت های 20-10 گرم در لیتر گلیسرول بیشتر از 15-5 گرم در لیتر دکسترین و نشاسته است . مناسبترین غلظت منابع کربنی و نیتروژنی در محیط های بذردهی به ترتیب 10 گرم در لیتر گلیسرول و 40 گرم در لیتر آرد سویا بوده است.

  • پژوهشی با عنوان اثر روغن کلزا بر روی رشد باکتری Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین در سال 1999 توسط نوشین میر جلیلی ، Vassilios zormapadis ، Peter leadly و Andrew P.ison صورت گرفت.

در این پژوهش اثر روغن کلزا بر روی رشد سویه Saccharopolyspora erythraea و تولید آنتی بیوتیک بررسی شد. نتیجه بدست آمده از این پژوهش حاکی از این بود که افزودن روغن کلزا به محیط کشت پایه موجب تولید بیشتر اریترومایسین A می شود.

  • پژوهشی با عنوان اثر شرایط محیط کشت در تولید اریترومایسین با استفاده از باکتری Saccharopolyspora erythraea در کشت های غیر پیوسته ، در سال 1996 در دانشگاه لندن توسط محمد حیدریان و همکارانش انجام شد. در این پژوهش اثر عواملی مانند فشار اکسیژن محلول ، شرایط محیط ، هم زدن و تعداد دور بر روی سویه مولد مورد نظر در تولید اریترومایسین بررسی شد. نتایج حاصل بدین صورت بود که فشار اکسیژن محلول در رشد باکتری و تولید اریترومایسین بی اثر بوده اما همزدن با دور های بالا موجب جدا شدن و شکستن میسلیوم ها می شود و بازده تولید را کاهش می دهد.
  • پایان نامه کارشناسی ارشد تحت عنوان بررسی اثر اسیدهای چرب در رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین که در سال 1383 توسط علی مخدومی به راهنمایی جواد حامدی در دانشکده علوم دانشگاه تهران انجام شد . در این پژوهش اثرات مجزا و بر هم کنش پنج اسد چرب و نیز متیل استر آنها در رشد باکتری Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین بررسی شد.

2-1) پیشینه پژوهش……………………………………………………………………………………………..88

فصل سوم : مواد و روش ها

این پژوهش به منظور بررسی اثر تاثیر استفاده از منبع نیتروژنی ( ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا ) در تولید اریترومایسین و در مجتمع آزمایشگاهی دانشگاه آزاد اسلامی ، واحد علوم دارویی انجام گرفته است و از آن جا که با استفاده از نتایج بدست آمده ، می توان تولید اریترومایسین را تا حدودی افزایش داد و بویژه هزینه های تمام شده تولید را پایین آورد و فرآیند تولید را اقتصادی تر نمود ، می توان اظهار داشت که این پژوهش جزء تحقیقات کاربردی محسوب می شود. روش گردآوری اطلاعات در این پژوهش از نوع کتابخانه ای – آزمایشگاهی بوده است.

در انجام این آزمایش از مواد ، وسایل و دستگاه هایی استفاده شده که در این فصل به توضیح و تشریح آن ها پرداخته شده است.

3-2 ) سویه های باکتری مورد استفاده در پژوهش

در این پژوهش برای تولید اریترومایسین از سویه 1685  Saccharopolyspora erythraea PTCC  استفاده شده است. این سویه مولد اریترومایسین از پژوهشکده بیوتکنولوژی ، مرکز کلکسیون قارچ ها و باکتری های صنعتی و عفونی ایران به صورت آمپول لیوفیلیزه ، خریداری و برای انجام پژوهش در اختیار مجتمع آزمایشگاهی دانشکده علوم و فناوری واحد علوم دارویی قرار گرفت.

3-1) روش گردآوری اطلاعات و انجام پژوهش………………………………………………………………………….93

3-2) سویه باکتری مورد استفاده در پژوهش……………………………………………………………………………93

3-3) معرفی رنگ های مورد استفاده……………………………………………………………………………………..94

3-4) محیط های کشت مورد استفاده…………………………………………………………………………………….95

3-4-1) محیط کشت اسپورزایی……………………………………………………………………………………………95

3-4-1-1) تهیه سوسپانسیون اسپوری…………………………………………………………………………………….98

3-4-2) محیط کشت مرحله بذردهی( پیش کشت_ seeding)…………………………………………………………..99

3-4-2-1) انتخاب بهترین ارلن در مرحله بذردهی…………………………………………………………………………100

3-4-3) محیط کشت مرحله تخمیر…………………………………………………………………………………………104

3-4-3-1) غلظت های کنجاله سویا و کنجاله کلزا مورد استفاده شده در محیط تخمیر……………………………105

3-5) نمونه گیری……………………………………………………………………………………………………………106

3-6) سنجش اریترومایسین تولید شده……………………………………………………………………………………106

3-6-1) تهیه بافر کربنات بی کربنات با pH 6/9 …….ا…………………………………………………………………..107

3-6-2) تهیه بافر با pH 6/9 اشباع از کلروفرم و کلروفرم اشباع از بافرpH 6/9 ……ا………………………………..108

3-6-3) تهیه بافر سیترات_فسفات با pH 2/4………..ا…………………………………………………………………108

3-6-4) تهیه محلول بروموفنل بلو…………………………………………………………………………………………108

3-6-5) تهیه محلول های استاندارد اریترومایسین………………………………………………………………………109

3-6-6) استخراج اریترومایسین از مایع تخمیر با استفاده از کلروفرم………………………………………………111

3-6-7) تشکیل کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو……………………………………………………….112

3-6-8) اندازه گیری میزان جذب کمپلکس رنگی اریترومایسین و بروموفنل بلو……………………………………..113

3-7) محیط کشت پایه سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین……………………………………………………….113

3-7-1) محیط کشت مولر هینتون آگار…………………………………………………………………………………..113

3-7-2) محیط کشت مولر هینتون براث…………………………………………………………………………………114

3-7-3) استخراج اریترومایسین از محیط کشت تخمیر…………………………………………………………………114

3-7-4) سنجش میکروبیولوژیک اریترومایسین………………………………………………………………………….114

3-7-5) تهیه مایع تلقیح………………………………………………………………………………………………….115

3-7-6) تهیه چاهک………………………………………………………………………………………………………116

3-7-7) تهیه بافر فسفات با pH 8……………….ا……………………………………………………………………116

3-7-8) تهیه محلول های استاندارد…………………………………………………………………………………….116

3-7-9) افزودن محلول های آنتی بیوتیک در پلیت ها…………………………………………………………………117

3-7-10) اندازه گیری قطر هاله مهار رشد……………………………………………………………………………..117

3-7-11) رسم منحنی استاندارد………………………………………………………………………………………..117

3-8) سنجش غلظت اریترومایسین به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا……………………………………..118

3-8-1) فاز متحرک…………………………………………………………………………………………………………118

3-8-2) آماده سازی مایع تخمیر…………………………………………………………………………………………..118

3-8-3) اندازه گیری مقداراریترومایسین………………………………………………………………………………….119

فصل چهارم: نتایج پژوهش

 

4-1) بررسی اثر کنجاله سویا بر رشدSaccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین ( محیط شاهد )…………………………………………………………………………………………………………………………….123

4-1-1) اثر کنجاله سویا در pH محیط کشت تولید اریترومایسین (کنترل)…………………………………………….123

4-1-2) اثر کنجاله سویا بر درصد بیومس تولید شده (کنترل)…………………………………………………………..124

4-1-3) اثر کنجاله سویا در میزان تولید اریترومایسین ( کنترل)………………………………………………………….125

4-1-4) بررسی اثر کنجاله سویا بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea (کنترل)………………………..125

4-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر تولید اریترومایسین……………………………………………….128

4-2-1) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر pH محیط کشت……………………………………………..129

4-2-2) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر بیومس تولیدی…………………………………………………130

4-2-3) بررسی اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا بر میزان اریترومایسین تولیدی………………………………….130

4-3) غلظت بهینه ترکیب کنجاله سویا و کلزا برای محیط کشت تولید اریترومایسین…………………………………131

4-4) اثر ترکیب کنجاله سویا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر و کنجاله کلزا با غلظت بهینه 15 گرم در لیتر بر روی پارامترهای مورد بررسی درتخمیر……………………………………………………………………………………………………………….132

4-4-1) بررسی اثر غلظت بهینه در میزان تولید اریترومایسین…………………………………………………………….132

4-4-2) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی pH محیط کشت تخمیر…………………………………………………………133

4-4-3) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی درصد بیومس تولیدی……………………………………………………………133

4-4-4) بررسی اثر غلظت بهینه بر روی مورفولوژی Saccharopolyspora erythraea…..ا…………………………….134

برای دانلود رایگان قسمت های بیشتراز فایل به انتهای مطلب مراجعه کنید

فصل پنجم: بحث و پیشنهادات

افزایش تولید محصول یکی از جنبه های مهم تحقیقات در بیوتکنولوژی است و با توجه به اینکه آنتی بیوتیک ها از نظر حجم مصرف رتبه دوم را در بین این فرآورده ها دارند، پژوهش های گسترده ای در جهت افزایش تولید این فرآورده ها انجام شده که در آنها ، سویه میکروارگانیسم و یا بهینه سازی شرایط محیطی تولید محور پژوهش بوده است . پژوهش های انجام گرفته بر سوی مولد آنتی بیوتیک ها ، که عمدتا بر ژنتیک این سویه ها استوار می باشد، در صنعت کاربرد زیادی نداشته اما محور دیگر فعالیت های انجام شده که مبتنی بر بهینه سازی شرایط محیطی تولید آنتی بیوتیک است ، نسبت به سایر فرآیند های بیوتکنولوژیک اهمیت بیشتری پیدا کرده و موضوع پژوهش های متعددی بوده است .یکی از نکات مهم در امر بهینه سازی شرایط محیط ، انتخاب یک محیط مناسب برای کشت و رشد میکروارگانیسم ها می باشد تا آنها بتوانند تواناییشان را در تولید محصول به نمایش گذارند. برای بدست آوردن حداکثر تولید محصول ، مطالعه کامل شرایط کشت میکروارگانیسم مربوط ، تاثیرات عناصر مختلف سوبسترا ، ترکیبات و مقادیر محیط کشت ( بویژه منابع کربن و نیتروژن در دسترس) ، فاکتورهای فیزیکی و شیمیایی محیط کشت، از جمله مهم ترین نکاتی هستند که لازم است به آنها توجه نمود. با آزمایش شرایط گوناگون برای کشت میکروارگانیسم ها و تغییر در نوع و مقدار سوبسترا ، می توان کشف کرد که کدام یک از شرایط برای بیوسنتز محصول سودمندترین بوده و سپس با تغییر شرایط کشت میکروارگانیسم ها ، بازده را به حداکثر رساند. در این پژوهش اثر ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا در تولید اریترومایسین توسط Saccharopolyspora  erythraea  با هدف بهینه سازی ترکیبات محیط کشت تخمیر از نظر منابع نیتروژنی بررسی شده است .

5-1) تاثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات بکار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک

برای تولید آنتی بیوتیک و در کل متابولیت های ثانویه ، محیط کشت باید به گونه ای طراحی شود که یک دوره رشد اولیه سلولی را تامین و بعد از آن شرایط بهینه را برای تولید متابولیت ثانویه فراهم کند. محدودیت منابع اصلی مغذی در محیط کشت ، سبب محدودیت در رشد میکروارگانیسم و تولید محصول می شود . به همین دلیل می توان گفت که ارتباط زیادی بین ترکیبات به کار رفته در محیط تخمیر با تولید آنتی بیوتیک ها وجود دارد . به دلیل نقش اصلی منبع نیتروژن در تولید اریترومایسین و از آنجایی که در این پژوهش سنجش روی منبع نیتروژنی انجام شده ، در ادامه به بحث پیرامون این موضوع می پردازیم .

5-1-1) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین

سوبستراهای نیتروژنی و غلظت آنها مستقیما بر پیش ساز بیوسنتز اریترومایسین و یا به صورت غیر مستقیم بر تنظیم متابولیسم آمونیوم و یا سرعت رشد باکتری اثر دارند . نمک های آمونیوم از اسیدهای آلی یا معدنی یکی از اشکال نیتروژن قابل جذب برای بسیاری از میکروارگانیسم ها هستند، اما از طرفی افزایش غلظت این نمک ها و یا سایر منابع نیتروژن مهار کننده تولید نیز می باشند .Sanches (1984) و Sanches & Flores  ( 1985) نشان دادند که در غلظت 50 mM آمونیوم نسبت به محیط شاهد دارای 10mM آمونیوم ، بازده تولید اریترومایسین 92% کاهش داشته است . Potvin & Pringer ( 1994) بیان کردند که غلظت بیش از حد آمونیوم نه تنها باعث کاهش میزان اریترومایسین تولیدی می شود ، بلکه باعث به تعویق افتادن زمان شروع تولید نیز می شود.از جمله سایر منابع نیتروژنی می توان به پپتون ها اشاره کرد . پپتونها که حاصل هیدرولیز پروتئین ها هستند می توانند توسط بیشتر میکروارگانیسم ها مصرف شوند . ترکیبات شیمیایی پپتون ها ، بسته به منشا تولیدی آن تفاوت می کند . مثلا پپتون حاصل از ژلاتین ، سرشار از پرولین و فاقد اسید آمینه گوگردی است. پپتون حاصل از کراتین ، مقدار زیادی پرولین و سیستئین دارد اما فاقد لیزین است .در این پژوهش ، کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منابع اصلی نیتروژن و سولفات آمونیوم و دی آمونیوم هیدروژن فسفات به عنوان منابع فرعی نیتروژن برای محیط کشت تخمیر استفاده شدند . لازم به ذکر است سولفات آمونیوم یک منبع مغذی زود هضم بوده که برای تسریع رشد باکتری و افزایش بیومس تولیدی استفاده شده است . مقدار آن در حدی است که باعث افزایش رشد نگردیده است .

5-1) تأثیر مواد تشکیل دهنده و ترکیبات به کار رفته در محیط کشت تخمیر در تولید آنتی بیوتیک…………………137

5-1-1) اثر منابع نیتروژنی در تولید اریترومایسین………………………………………………………………………….137

5-1-1-1) مقایسه اثر غلظت های مختلف ترکیب کنجاله سویا و کنجاله کلزا به عنوان منبع نیتروژنی در تولید اریترومایسین………………………………………………………………………………………………………………….138

5-2) همزمانی رشد Saccharopolyspora erythraea و تولید اریترومایسین………………………………………..144

5-3) رابطه بین میزان رشد باکتری و تغییرات بیومس در طول فرآیند…………………………………………………..145

5-3-1) سینتیک رشد میکروبی……………………………………………………………………………………………..146

5-4) رابطه بین منبع نیتروژنی استفاده شده در این پژوهش و pH محیط کشت تخمیر…………………………….148

5-5) رابطه بین مورفولوژی سویه مولد و تولید اریترومایسین………………………………………………………….149

5-6) برآورد هزینه ها………………………………………………………………………………………………………153

5-6-1) محاسبه میزان اریترومایسین تولیدی و قیمت تمام شده منبع نیتروژنی مورد استفاده در آن در هر Batch صنعتی……………………………………………………………………………………………………………………..153

5-6-1-1) استفاده از 30 گرم در لیتر کنجاله سویا (محیط کنترل) در تخمیر…………………………………………154

5-6-1-2) استفاده از ترکیب 15 گرم در لیتر کنجاله سویا و 15 گرم در لیتر کنجاله کلزا………………………….154

5-7) پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………156

منابع و مراجع……………………………………………………………………………………………………………158

خلاصه انگلیسی………………………………………………………………………………………………………..165

ضمائم …………………………………………………………………………………………………………………….166

 

Abstract:

Nowadays, erythromycin is one of the most common antibiotics that plays a significant role in the treatment of the wide range of diseases. There are five key stage for production of this antibiotic among which fermentation is the most important and most expensive one. The composition of fermentation media plays an important role in the titer and productivity of secondary metabolites and the cost of raw materials/product also nitrogen substrate is one of the most important and expensive component of media in this stage. So it is imperative to present an alternative nitrogen source with lower price and more acceptable efficiency. In this study , effect of different concentration of combination of two nitrogen sources ( soy bean- meal and rapeseed meal ) on erythromycin production were evaluated. The Saccharopolyspora erythraea string bacteria has been used for generation of erythromycin. Spore suspension was inoculated into flasks containing seeding media and incubated at 30for 40-44 hours with 200rpm in aerobic condition. The appropriate amount of seeding culture were added in to flasks containing fermentation media with =6/8 and then they were incubated at 33 for 11 days with 220rpm in aerobic condition.During the process the variations of bacteria morphology,PH and concentration of biomass have been measured since the fourth day on alternate days till end. The amount of erythromycin, were measured by specterophotometric. Concentrations of nitrogen sources were as following:

  • Soybean meal ( 50%) , rapeseed meal ( 50%) : each of them 15 gr/lit
  • Soybean meal ( 60% , 18 gr/lit ) , rapeseed meal ( 40% , 12 gr/lit)
  • Soybean meal ( 40% , 12 gr/lit) , rapeseed meal ( 60% , 18 gr/lit)
  • Soybean meal ( 70%, 21 gr/lit) , rapeseed meal ( 30% , 9 gr/lit)
  • Soybean meal ( 30% , 9 gr/lit) , rapeseed meal ( 70% , 21 gr/lit)

According to the result, the highest amount of erythromycin was obtained when we used the mixture of 15 gr per lit  Soybean meal and 15 gr per lit rapeseed meal. This option results in erythromycin production 1/011 times more than the case where 30 gram per litr soybean meal is used which is most common in industrial media.



بلافاصله بعد از پرداخت به ایمیلی که در مرحله بعد وارد میکنید ارسال میشود.


فایل pdf غیر قابل ویرایش

قیمت25000تومان

خرید فایل word

قیمت35000تومان