فهرست مطالب
فصل1

در این فصل به بیان توضیحاتی کلی درباره آنزیم ها، ساختار و ویژگی‌هایشان پرداخته می‌شود. سپس گروه‌های آنزیمی و واکنش‌های مرتبط بیان می‌شود. در ادامه مطالبی اجمالی درباره پروتئازها به عنوان یکی از مهمترین گروه‌‌های آنزیمی ذکر می‌شود. سپس فرآیند تخمیر حالت جامد بعنوان یک سیستم تخمیری کارآمد معرفی می‌شود. در انتها به ضرورت ها و اهداف این پروژه پرداخته می‌شود.
1-2. تعریف آنزیم
آنزیم‌ها، مهمترین گروه از پروتئین‌ها هستند که انجام واکنشهای بیوشیمیایی و سرعت بخشیدن به آنها را بر عهده دارند و می‌توانند سرعت واکنش را تا حدود 107 برابر افزایش دهند. آنزیم‌ها، توسط موجودات زنده، گیاهان و میکروارگانیسم‌ها تولید می‌شوند. انجام تمام واکنش‌ها در سلول زنده به آنزیم خاصی نیازمند است. همانطور که در شکل (1-1) نشان داده شده است، آنزیم مانند یک کاتالیزور غیر‌آلی در واکنش مصرف نشده اما مسیر انرژی پایین‌تر را برای اینکه واکنش صورت گیرد، فراهم می‌کند [1, 2]. کاتالیزورها در واکنش‌ها بدون تغییر می‌مانند، ولی آنزیم‌ها مانند سایر پروتئین‌ها تحت شرایط مختلف پایدار نمی‌مانند. برخی از آنزیم‌ها عمدتا در بازه محدودی از pH، دما و قدرت یونی فعال هستند و در دما و pH‌های بالاتر از میزان بهینه، آنزیم تخریب شده و فعالیت خود را ازدست می‌دهد [3, 4]. به دلیل شرایط خاص بسیاری از این آنزیم‌ها ، برای مصارف صنعتی پیشنهاد نمی‌شوند، لذا تلاش جهت یافتن گونه‌های جدیدی که جوابگوی نیاز صنعت باشند، یک فرآیند مستمر می‌باشد [5].
1-3. تاریخچه آنزیم
فعالیت کاتالیستی آنزیم‌ها، هزاران سال است که در فرآیند‌های مختلف مانند ساخت پنیر، شراب و نانوایی مورد استفاده قرار‌گرفته‌است [6]. تا قرن نوزدهم مشخص شده بود که فرایندهایی نظیر ترش شدن شیر و تخمیر قند به الکل فقط از طریق عمل یک موجود زنده رخ می‌دهند. در سال 1833 عامل فعال‌کننده قند به طور نسبی خالص شد و آن را دیاستاز نامیدند که اکنون به آن آمیلاز می‌گویند. چند سال بعد از شیره معده فردی که رژیم غذایی اوپروتئین بود ، ماده‌ای جدا کردند و آن را پپسین نامیدند. این ترکیبات را تحت نام کلی مخمر می‌نامیدند. لیبیگ در آن موقع اظهارداشت که این مخمرها می توانند مواد غیر زنده‌ای باشند که از سلول‌های زنده به دست می‌آیند در حالی‌که پاستور و دیگران هنوز بر این باور بودند که مخمرها بایستی حاوی مواد زنده باشند. با وجود این اختلاف نظرها ، کوهن در سال 1878، این مولکول‌ها را آنزیم نامید. بوخنرز در سال 1897 نشان داد که وقتی عصاره مخمر به قند اضافه شود، تخمیر قند صورت می‌گیرد. درسال 1926 سامنر آنزیم اوره آز را ازعصاره لوبیا خالص‌کرد و آن را کریستاله نمود. از آن به بعد تعداد زیادی از آنزیم‌ها را توانستند به شکل بلور درآورند [7, 8]. همزمان با بوجود آمدن دانش خالص‌سازی آنزیم‌ها، موارد کاربرد آنها چندین برابر شد و البته با استفاده از آنزیم‌های مهندسی شده، تعداد انتخاب‌ها برای فرآیندهای صنعتی افزایش یافت [6].

1-4. ساختار آنزیم
هر آنزیم دارای ساختار سه بعدی اختصاصی بوده که تعیین کننده عملکرد آنزیم می‌باشد. این ساختار وابسته به نحوه اتصال اسیدهای آمینه بوده و تغییرات جزئی در این اتصالات، تاثیرات شگرفی بر ساختمان پروتئین می‌گذارد. این تغییرات نه تنها باعث تغییر در ظاهر بلکه تغییر در عملکرد آنزیم را نیز سبب می‌شود. یکی از خصوصیات منحصر بفرد آنزیم‌ها، دارا بودن عملکرد ویژه می‌باشد. با اینکه آنزیم‌ها مولکول‌های بزرگی متشکل از صدها اسیدآمینه مختلف می‌باشند اما تنها بخش کوچکی از آنها در کاتالیزاسیون واکنش‌های بیوشیمیایی دخالت دارد، این بخش جایگاه فعال آنزیم نامیده می‌شود که شکل ظاهری این جایگاه بستگی به ساختار سه بعدی آنزیم دارد. در مورد اتصال آنزیم به سوبسترا دو فرضیه ارائه شده است (شکل1-2). الگوی ساده ای که این خصوصیت را شرح می‌دهد مدل قفل و کلید است که توسط فیشر پیشنهاد شده است. در این مدل، آنزیم همانند قفل و سوبسترا همانند کلید عمل می‌کند و جایگاه فعال آنزیم دقیقا مناسب سوبسترا است. در مقابل در الگوی القایی که توسط کوشلند ارائه شد، محل اتصالل حالت انعطاف پذیری داشته و اتصال سوبسترا باعث تغییر در ساختار آنزیم می‌شود [9-11].

شکل1-2. شماتیکی از مدل‌های ارائه شده برای جایگاه فعال آنزیمی، (1): مدل قفل و کلید، (2): مدل القایی

شکل1-2. شماتیکی از مدل‌های ارائه شده برای جایگاه فعال آنزیمی، (1): مدل قفل و کلید، (2): مدل القایی

مقدمه ………………………………………………………………………………1
1-1. مقدمه……………………………………………………………………….. 2
1-2. تعریف آنزیم…………………………………………………………………. 2
1-3. تاریخچه آنزیم……………………………………………………………….. 2
1-4. ساختار آنزیم……………………………………………………………….. 4
1-5. تقسیمبندی آنزیم‌ها……………………………………………………….. 5
1-6. تاریخچه آنزیم پروتئاز………………………………………………………. 6
1-7. عملکرد پروتئازها …………………………………………………………….7
1-8. تخمیرحالت جامد…………………………………………………………….. 7
1-9. ضرورت انجام پروژه…………………………………………………………. 8
1-10. اهداف این پروژه………………………………………………………….. 8

برای دانلود رایگان قسمت های بیشتراز فایل به انتهای مطلب مراجعه کنید

فصل2 مروری بر منابع مطالعاتی

در این فصل، در ابتدا به ارائه توضیحاتی درباره پروتئازها شامل منابع تولیدکننده، تقسیم بندی، مکانیزم عمل، کاربرد‌ در صنایع مختلف و روش‌های مختلف تولید پرداخته می‌شود. سپس ویژ‌گی‌های مختلف فرآیند تخمیر حالت جامد که تولید آنزیم در این پروژه بر اساس آن صورت گرفته، مراحل انجام، میکروارگانیسم های مورد استفاده و آنزیم های تولیدی، بیان می شود. در انتها طراحی بیوراکتور، چالش‌های پیش رو و بیوراکتورهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد، مزایا و معایبشان بررسی می‌شود.
2-2. پروتئازها
آنزیم‌های پروتئولیتیک ، در تمام ارگانیزم‌های زنده یافت شده و برای رشد و تقسیم سلول ضروری می‌باشند [21]. پروتئاز‌ها درطبیعت عملکردهای مختلفی دارند. پروتئاز های میکروبی برون سلولی از طریق هیدرولیز مولکول‌های پپتیدی بزرگ به مولکول‌های کوچکتر که قابل جذب توسط سلول باشند، در تغذیه ارگانیسم‌های مولد، نقش حیاتی ایفا می‌کنند. در کلیه سیستم های متابولیکی که شامل سنتز و تخریب پروتئین است، تعادل وجود ‌داشته و پروتئازهای درون سلولی در فرآیندهای نوسازی پروتئینی نقش حیاتی ایفا می‌کنند [22]. این آنزیم‌ها نه تنها نقش مهمی در فرآیندهای متابولیک سلولی ایفا می‌کنند، بلکه توجه قابل ملاحظه ای نیز در جامعه صنعتی کسب نموده‌اند، لذا علاقه تازه‌ای نسبت به مطالعه و بررسی آنزیم‌های پروتئولیتیک بوجود‌آمده‌است [23]. پروتئازها، مهمترین گروه آنزیم‌هایی هستند که بصورت تجاری تولید گشته و در صنایع شوینده، آب جو‌سازی، عکاسی، غذایی و چرم‌سازی مورد استفاده قرار‌می‌گیرند. استفاده از آنها در صنعت چرم، جایگزین بسیار خوبی برای مواد شیمیایی سمی است که حتی امروزه نیز آنها، استفاده می‌گردد [24].
پروتئازی با اهمیت تجاری از منابع میکروبی، حیوانی و گیاهی تولید می‌شوند. محصولات بدست آمده شامل گستره وسیعی از آنزیم‌ها با خواص متفاوت سوبسترا، سایت فعال، مکانیزم کاتالیستی، فعالیت در pH و دماهای مختلف می‌باشند. پروتئازهای صنعتی در فرآیندهایی کاربرد‌ دارند که از خواص فیزیکی- کاتالیزوری منحصر به فرد آنها، بتوان استفاده‌کرد. این تنوع وسیع پروتئاز‌ها در کنار اختصاصی عمل کردن آنها، توجه جهانی را در خصوص بهره‌برداری از کاربردهای فیزیولوژیک و بیوتکنولوژی آنها، جلب نموده‌است [6].
2-3. منابع پروتئازها
از آنجا که پروتئازها از نظر فیزیولوژیکی برای همه ارگانیسم‌های زنده ضروری هستند، در منابع مختلف گیاهی، حیوانی و میکروارگانیسم ها یافت می‌شوند [25].
2-3-1. پروتئازهای گیاهی
در استفاده از گیاهان به عنوان منبع پروتئازها، عوامل متعددی مانند در دسترس بودن زمین برای کشت و مناسب بودن شرایط آب و هوایی برای رشد، اهمیت دارد و همچنین باید در نظر داشت که تولید پروتئازها از منابع گیاهی فرآیندی زمان بر است. پاپایین ، فیسین و بروملین پروتئازهای گیاهی شناخته شده هستند [26, 27]. پاپایین پروتئاز گیاهی سنتی است که تاریخچه استفاده از آن طولانی است. این آنزیم در صنایع غذایی برای تولید ماءالشعیر، تولید نان و بیسکوییت، تردسازی گوشت و در صنایع پزشکی اهمیت دارد. پاپایین از میوه سبز گیاه کارسیا پاپایا ، که در نواحی استوائی غرب و مرکز آفریقا و هند رشد می‌کند، استخراج می‌شود. مقدار آنزیم در گیاه به شرایط رشد بستگی دارد و بیشترین آنزیم در گیاهی یافت می‌شود که درتمام سال در معرض نور خورشید باشد. عملکرد آنزیم به منبع گیاهی آن، شرایط آب و هوایی و روشهای استفاده برای استخراج و تخلیص آن برمی‌گردد. آنزیم بین pH های 5 و 9 فعال است و تا دماهای 80 و یاC °90، در حضور سوبستراها پایدار است [25, 27]. بروملین در میوه خام و آب میوه تازه آناناس یافت می‌شود. این آنزیم خصوصیات و موارد مصرفی شبیه پاپایین داشته، با این تفاوت که به دمای بالا حساس است [26]. آنزیم گیاهی دیگر فیسین بوده که از لاتکس درخت انجیر وحشی بدست می‌آید و درخت بالغ لاتکس بیشتری تولید می‌کند. فیسین خصوصیات و عملکردی مشابه بروملین دارد [6].
2-3-2. پروتئازهای حیوانی
شناخته شده ترین پروتئازهای با منبع حیوانی، تریپسین ، کیموتریپسین ، پپسین و رنین ها هستند که بصورت زیاد و در مقادیر خاص تهیه می‌شوند. با این وجود، تولید آنها به دردسترس بودن دام‌ها بر‌می‌گردد که قوانین سیاسی و کشاورزی آن را محدود می‌کند [25]. معمولا اعضای حیوانی حاوی آنزیم از کشتارگاه‌ها تهیه می‌شود. اعضای جمع آوری شده را تا زمان استخراج، بوسیله خشک کردن، انجماد و یا نمک سود‌کردن نگه‌داری می‌کنند [28].
2-3-3. پروتئازهای میکروبی
به دلیل اینکه منابع گیاهی و حیوانی نتوانستند تقاضای مورد نیاز را تأمین کنند، امروزه منابع میکروبی بسیار مورد توجه قرار گرفته است. میکروارگانیسم‌ها منبع خوبی برای تولید آنزیم هستند، زیرا از لحاظ بیوشیمیایی بسیار وسیع و دردسترس هستند و از لحاظ ژنتیکی می‌توان تغییراتی را در آنها، انجام داد. پروتئازهای میکروبی تقریبا 40 % از فروش آنزیم دنیا را در اختیار دارند. پروتئازهای بدست آمده از منابع میکروبی به آنزیم بدست آمده از منابع گیاهی و حیوانی ترجیح داده می‌شوند، زیرا عموما خارج سلولی بوده و فرآیند‌های پایین دستی با سهولت بیشتری انجام می‌شود و همچنین تمام خصوصیات مورد نیاز فرآیندهای بیولوژیکی را دارا هستند [25, 29].

شکل2-1. ارتباط فرآیندهای میکرو و ماکرو در فرآیند تخمیر حالت جامد

شکل2-1. ارتباط فرآیندهای میکرو و ماکرو در فرآیند تخمیر حالت جامد

2-1. مقدمه. ………………………………………………………………………..11
2-2. پروتئازها……………………………………………………………………… 11
2-3. منابع پروتئازها ………………………………………………………………..12
2-3-1. پروتئازهای گیاهی……………………………………………………….. 12
2-3-2. پروتئازهای حیوانی……………………………………………………….. 13
2-3-3. پروتئازهای میکروبی………………………………………………………. 13
2-4. تقسیم بندی پروتئازها……………………………………………………… 16
2-5. پروتئازهای قلیایی………………………………………………………….. 19
2-6. مکانیزم عمل پروتئازها ……………………………………………………..22
2-7. کاربردهای صنعتی آنزیم پروتئاز…………………………………………… 22
2-7-1. صنعت مواد شوینده ……………………………………………………..23
2-7-2. صنایع غذایی……………………………………………………………… 24
2-7-3. صنعت چرم ………………………………………………………………..25
2-7-4. صنعت عکاسی…………………………………………………………. 25
2-7-5. صنایع دارویی……………………………………………………………. 26
2-7-6. مدیریت محیط زیست…………………………………………………… 26
2-8. تولید آنزیم پروتئاز………………………………………………………….. 27
2-9. تخمیر حالت غوطه ور……………………………………………………. 28
2-9-1. تخمیر حالت جامد……………………………………………………… 28
2-9-2. مقایسه سیستمهای تخمیر جامد و غوطهور………………………. 29
2-9-3. انتقال جرم در تخمیر حالت جامد……………………………………. 30
2-9-4. عملیات انتقال جرم در مقیاس ماکرو………………………………. 30
2-9-5. عملیات انتقال جرم در مقیاس میکرو……………………………….. 31
2-9-6. انتقال اکسیژن………………………………………………………… 32
2-9-7. نفوذ آنزیمها………………………………………………………….. 33
2-9-8. جنبههای انتقال حرارت………………………………………………. 34
2-9-9. میکروارگانیزمهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد…………… 35
2-9-10. کاربردهای تخمیر حالت جامد………………………………………. 36
2-9-11. آنزیمهای بدست آمده از فرآیند تخمیر جامد……………………… 37
2-10. طراحی بیوراکتور………………………………………………………. 38
2-11. انواع بیوراکتورهای مورد استفاده در تخمیر حالت جام……………د 39
2-11-1. بیوراکتورهای سینیدار…………………………………………….. 40
2-11-2. بیوراکتورهای بسترپرشده………………………………………… 41
2-11-3. بیوراکتورهای استوانه ایدوار……………………………………… 42
2-11-4. بیوراکتورهای بسترسیال………………………………………….. 44
2-12. مراحل عمومی برای انجام فرآیند SSF در داخل بیوراکتور …………46
2-13. عوامل مؤثر در تولید پروتئاز در فرآیند SSF در داخل بیوارکتور……. 47

فصل3 مواد و روشها

در این فصل در ابتدا دستگاههایی که هر کدام با هدف خاصی مورد استفاده قرار گرفته‌است، معرفی می‌شود. سپس روش‌های مختلف به منظور تعیین مشخصات سوبسترای مورد استفاده توضیح داده می‌شود. در ادامه ویژگی‌های میکروارگانیسم مورد نظر، روش تهیه محیط کشت و مایه تلقیح و همچنین شرایط بهینه برای رشد باکتری بیان می‌شود. سپس مشخصات و ویژگی‌های بیوراکتور، تولید آنزیم به روش تخمیر حالت جامد در بیوراکتور، استخراج محصول و نحوه محاسبه فعالیت بیان می‌شود. همچنین تأثیر پارامترهای مختلف بر روی تولید پروتئاز، ویژگی‌های آنزیم تولیدی، کاربرد در پردازش چرم، هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلم های عکاسی و عملکرد آنزیم به عنوان افزودنی به شوینده مورد بررسی قرار می‌گیرد. در نهایت مقایسه‌ای بین تولید پروتئاز در بیوراکتور سینی دار و فلاسک صورت گرفته و به منظور صحه گذاردن بر نتایج، چند پارامتر تأثیر گذار بر تولید، بررسی می‌شود.
تجهیزات مورد استفاده
اتوکلاو: اتوکلاو مورد نظر ساخت شرکت Hirayama کشور ژاپن می‌باشد
انکوباتور: دستگاه مورد استفاده ساخت شرکت پارس آزما در ایران می‌باشد.
حمام آب گرم: حمام آب گرم مدل TW12 و ساخت شرکت Julabo در کشور آلمان می‌باشد.
شیکر انکوباتور: دستگاه مورد نظر مدل Ks4000icontrol ساخت شرکت IKA کشور آلمان می‌باشد.
آون: دستگاه آون ساخت شرکت Binder آلمان می‌باشد.
اسپکتروفتومتر: دستگاه مورد استفاده مدل SERIES ساخت کشور آمریکا می‌باشد.
دستگاه اندازه‌گیری pH و دما: دستگاه اندازه‌گیری pH مدل HANNA مورد استفاده قرار‌گرفت.
کوره:دستگاه مورد استفاده ساخت شرکت Nabertherm در کشور آلمان می‌باشد.
سانتریفیوژ: دستگاه سانتریفیوژ مورد استفاده، مدل Z 233 M-2، ساخت شرکت HERMLE در کشور آلمان می‌باشد.
پمپ خلاء: پمپ خلاء مورد نظر ساخت شرکت Platinum کشور آمریکا می‌باشد.
ترازو: ترازوی مورد استفاده دارای دقت 001/0 گرم و ساخت شرکت And آلمان می‌باشد.
پمپ پریستالتیک: دستگاه مورد استفاده Etatron و محصول کشور ایتالیا می‌باشد.
نمایشگر و کنترل رطوبت: کنترلر رطوبت مورد استفاده مدل DS Fox با دقت% 2± و ساخت کشور کره می‌باشد.
نمایشگر و کنترل دما: کنترلر رطوبت مورد استفاده مدل Samwon ENG با دقت 1+%2/0± و محصول کشور کره می‌باشد.
فن: فن های موورد استفاده، فن های رایانه (12 ولت و 18/0 آمپر) و محصول کشور کره می‌باشد.
تعیین مشخصات سوبسترا
در این بررسی از ضایعات مختلفی چون سبوس گندم، سبوس برنج، باگاس، پوسته ذرت، آرد ‌ذرت و آرد‌ جو استفاده گردید. برای استفاده از ضایعات کشاورزی در تخمیر‌حالت‌جامد، ابتدا به منظور حذف ذرات گرد و غبار، ضایعات مورد استفاده با آب مقطر شستشو داده شدند. بعد از گذشت 24 ساعت و خشک شدن ذرات سوبسترا در آون با دمای C°60، بوسیله آسیاب به ذراتی با اندازه مطلوب درآمده و تا زمان استفاده در یخچال با دمای C° 4 نگهداری‌گردید.
محاسبه میزان خاکستر
ابتدا بوته‌چینی را وزن نموده، سپس یک گرم از سوبسترای جامد که از قبل درون آون خشک شده، داخل بوته چینی ریخته می‌شود. مجموع بوته چینی و نمونه به مدت دو ساعت داخل کوره‌ای با دمای C°600 قرار‌داده‌شد. پس از سرد شدن، وزن مجموع بوته و خاکستر اندازه‌گیری شد. با استفاده از رابطه (3-1)، می‌توان درصد خاکستر را محاسبه نمود.
100 × (M2-M1)/(نمونه وزن) =درصد خاکستر
در رابطه (3-1)، M1 وزن بوته چینی و M2 مجموع وزن بوته و خاکستر نهایی می‌باشد.
محاسبه میزان رطوبت
به منظور محاسبه میزان رطوبت سوبسترای جامد، ابتدا شیشه را وزن نموده، میزان دلخواهی از سوبسترا را داخل شیشه ساعت ریخته و سپس مجموع شیشه و سوبسترای جامد وزن نموده و درون آون با دمای Cº105 قرار داده می‌شود. در بازه‌های زمانی اختیاری، این مجموعه را از داخل آون بیرون آورده و وزن شد. زمانی که تغییرات وزن آنها به صفر رسید، وزن نهایی اندازه‌گیری شد. میزان رطوبت از رابطه (3-2) بدست می‌آید.
100 × (M2-M3)/M1 =درصد رطوبت
در رابطه (3-2)، M1 وزن دلخواه از سوبسترای جامد، M2 مجموع وزن اولیه شیشه ساعت و سوبسترای جامد و M3 مجموع وزن نهایی شیشه ساعت و سوبسترا می‌باشد.
محاسبه میزان قند موجود در سوبسترا
مواد موجود در طبیعت دارای قندهای متفاوت و پلیمری هستند؛ اما مبنای محاسبات خود را بر اساس گلوکز قرار داده‌شد. لازم است کلیه ترکیبات قندی موجود هیدرولیز‌شده و به قندهای قابل تخمیر تبدیل شوند. اگر از هیدرولیز استفاده نشود، در محاسبه میزان قند، خطا بوجود می‌آید. هیدرولیز به دو روش اسیدی و آنزیمی انجام می‌گیرد. به دلیل عدم دسترسی به آنزیم، هیدرولیز اسیدی انجام‌شد.
به منظور تهیه معرف قند، 10 گرم دی‌نیترو‌سالسیلیک اسید را به 200 میلی‌لیتر محلول هیدروکسید‌سدیم 2 مولار اضافه شد. سپس این مخلوط را روی استیرر گرم‌کن‌دار، گرم کرده تا محلولی یکنواخت بدست‌آمد. بطور جداگانه، 300 گرم تارترات مضاعف‌ سدیم و پتاسیم در 500 میلی‌لیتر آب مقطر حل‌شد. در انتها این دو محلول را با هم مخلوط‌کرده و حجم نهایی را به 1 لیتر رسانده شد. محلول نهایی حاصل شده، همان معرف قند است. این معرف تنها قابلیت شناسایی قندهای مونومری از جمله گلوکز و فروکتوز را دارد. برای استفاده از معرف قند، باید منحنی استاندارد قند مربوط با این معرف را داشته باشیم. برای رسم منحنی استاندارد از محلول گلوکز g/l 2 استفاده می‌شود. با تأثیر معرف DNS بر غلظت های مختلف از محلول استاندارد گلوکز و خواندن جذب نمونه ها در طول موج 540 نانومتر منحنی استاندارد رسم می‌شود (شکل3-1). سپس در طول آزمایش با مراجعه به منحنی استاندارد و استفاده از روش طیف‌سنجی‌نوری، می‌توان غلظت قند را محاسبه نمود.

شکل2-5. بیوراکتور بستر‌سیال

شکل2-5. بیوراکتور بستر‌سیال

3-1. مقدمه…………………………………………………………………. 49
3-2. تجهیزات مورد استفاده……………………………………………… 49
3-3. تعیین مشخصات سوبسترا……………………………………….. 50
3-3-1. محاسبه میزان خاکستر…………………………………………. 50
3-3-2. محاسبه میزان رطوبت……………………………………………. 51
3-3-3. محاسبه میزان قند موجود در سوبسترا…………………………. 51
3-3-4. محاسبه میزان پروتئین……………………………………………. 52
3-3-5. تعیین درصد مواد استخراجی……………………………………. 54
3-3-6. تعیین درصد سلولز……………………………………………….. 54
3-3-7. تعیین درصد لیگنین……………………………………………… 55
3-3-8. تعیین درصد همی‌سلولز………………………………………. 55
3-3-9. محاسبه اندازه ذرات سوبسترا………………………………… 55
3-4. میکروارگانیسم و محیط کشت…………………………………….. 56
3-4-1. انتخاب میکروارگانیسم…………………………………………… 56
3-4-2. مشخصات میکروارگانیسم………………………………………. 57
3-4-3. محیط کشت……………………………………………………….. 57
3-4-4. تهیه مایه تلقیح………………………………………………….. 59
3-4-5. منحنی رشد باکتری……………………………………………. 60
3-4-6. تعیین pH بهینه باکتری………………………………………… 60
3-5. تخمیر حالت جامد……………………………………………….. 61
3-6. نمونهگیری و استخراج آنزیم از سوبسترای تخمیریافته ………63
3-7. فعالیت پروتئاز……………………………………………………. 64
3-7-1. منحنی استاندارد تیروزین…………………………………… 65
3-8. بررسی تأثیر پارامترهای مختلف بر روی تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور سینی‌دار………………………………………………………………… 66
3-8-1. تأثیر نوع سوبسترای جامد……………………………………. 66
3-8-2. تأثیر مدت زمان تخمیر…………………………………………. 67
3-8-3. اثر دما………………………………………………………….. 67
3-8-4. تأثیر pHا…………………………………………………………. 67
3-8-5. اثر پارامترهای مختلف بر روی استخراج آنزیم……………… 68
3-8-6. تأثیر رطوبت اولیه سوبسترا…………………………………. 68
3-8-7. تأثیر رطوبت داخلی راکتور…………………………………….. 68
3-8-8. تأثیر اندازه ذرات…………………………………………………. 68
3-8-9. تأثیر میزان تلقیح……………………………………………….. 69
3-8-10. تأثیر غنیسازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی……… 69
3-8-11. تأثیر pH بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی ………………….69
3-8-12. تأثیر دما بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی…………………. 70
3-9. کاربردهای آنزیم تولیدی………………………………………….. 71
3-9-1. افزودنی به مواد شوینده……………………………………….. 71
3-9-2. پردازش چرم……………………………………………………. 71
3-9-3. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلم‌های عکاسی و آزاد سازی نقره. 72
3-10. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک…………….. 72

فصل4 نتایج و تفسیر آنها

پارامتر زمان از مهمترین عواملی است که به منظور تولید آنزیم پروتئاز با بیشترین فعالیت بایستی در نظر گرفته شود. از نمونه های موجود در سینی‌ها به فاصله زمانی 24 ساعت به مدت 5 روز نمونه گرفته‌شد. نتایج در شکل (4-2) نشان می‌دهد که بیشترین میزان پروتئاز پس از گذشت 48 ساعت تولید شده‌است. از دلایل اصلی کاهش تولید آنزیم پس از 48 ساعت می تواند دگرگونی ساختار آنزیم و کاهش مواد غذایی در دسترس توسط میکروارگانیسم باشد [92]. همچنین نتایج نشان می‌دهد که پروتئاز تولیدی در سینی پایینی، در زمان‌های مختلف دستخوش تغییرات چندانی نشده و مقدار آن در مقایسه با فعالیت آنزیم تولیدی در سینی‌های بالایی و میانی بطور قابل ملاحظه‌ای کمتر بوده‌است، در نتیجه برای مطالعات بعدی در نظر نگرفته شده است. پروتئین کلی محلول آنزیمی نیز در شکل (4-3) نشان داده شده است. در واقع این پارامتر به منظور صحه گذاردن به نتایج گرفته‌شده از فعالیت آنزیمی مورد بررسی قرار‌گرفته‌است، چون همچنان که از نتایج بر می‌آید، میزان پروتئین کلی محلول آنزیمی با فعالیت بیشتر، بیشتر از این مقدار برای محلول آنزیمی با فعالیت کمتر بدست آمده‌است. همچنین به جز در مواردی محدود، میزان فعالیت آنزیمی و پروتئین کلی محلول آنزیمی در سینی بالایی بیشتر از سینی پایینی بوده‌است. سینی بالایی محلول محیط کشت از نازل را بطور مستقیم دریافت می‌کند، در حالیکه سینی میانی مایعی را که از منافذ سینی بالایی به آن نفوذ کرده، دریافت می‌کند. در نتیجه سوبسترای موجود درسینی اول مواد مغذی بیشتری دریافت می‌کند و پروتئاز با فعالیت بیشتری تولید می‌کند. این نتایج نشان می‌دهد که بیوراکتور سینی دار مورد استفاده، طراحی مؤثری داشته و با افزایش زمان تخمیر و کاهش مواد مغذی در محیط، بر روی رشد میکروارگانیسم و تولید پروتئاز تأثیرگذار است.

شکل4-23. عملکرد پروتئاز قلیایی

شکل4-23. عملکرد پروتئاز قلیایی

4-1. مقدمه…………………………………………………………………… 74
4-2. محاسبه خصوصیات سبوس گندم…………………………………… 74
4-3. منحنی رشد باکتری ……………………………………………………75
4-4. pH بهینه رشد باکتری………………………………………………… 75
4-5. بررسی پارامترهای مختلف بر تولید پروتئاز…………………………. 76
4-5-1. تأثیر مدت زمان تخمیر……………………………………………….. 76
4-5-2. بررسی تأثیر نوع سوبسترای جامد………………………………. 78
4-5-3. بررسی پارامترهای مؤثر بر استخراج پروتئا.ز……………………… 79
4-5-4. تأثیر pH ابتدایی…………………………………………………….. 82
4-5-5. بررسی دمای داخل بیوراکتور……………………………………. 82
4-5-6. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا……………………………………. 84
4-5-7. تأثیر رطوبت داخلی بیوراکتور ………………………………………85
4-5-8. تأثیر اندازه ذرات……………………………………………………. 86
4-5-9. تاثیر میزان مایه تلقیح…………………………………………….. 87
4-5-10. بررسی تأثیر غنی سازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی 87
4-6. بهینه سازی شرایط فعالیت پروتئازی آنزیم…………………………. 92
4-6-1. تعیین pH بهینه فعالیت آنزیم ……………………………………..92
4-6-2. تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیم…………………………………. 94
4-6-3. تعیین pH پایداری آنزیم…………………………………………… 95
4-6-4. تعیین دمای بهینه پایداری آنزیم…………………………………. 96
4-7. کاربردهای آنزیم پروتئاز قلیایی حاصل از B.licheniformis ا………98
4-7-1. عملکرد پروتئاز قلیایی به عنوان افزدونی به شوینده…………. 98
4-7-2. موزدایی از پوست …………………………………………………98
4-7-3. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلم‌های X-Rayا……………………….. 99
4-8. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک ……………….100

برای دانلود رایگان قسمت های بیشتراز فایل به انتهای مطلب مراجعه کنید

فصل5 نتیجهگیری و پیشنهادها

از آنجا که تاکنون هیچ گزارش قابل توجهی در زمینه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور سینی‌دار مشاهده نشده‌است، هدف اصلی در این پروژه تولید آنزیم پروتئاز قلیایی با فعالیت بالا در یک بیوراکتور سینی‌دار توسط باکتری B. licheniformis وسپس تعیین ویژگی‌های آنزیم تولید شده بود. به منظور کاهش هزینه‌های تولید، از ضایعات و محصولات مختلف کشاورزی شامل سبوس گندم، سبوس برنج، آرد ذرت، پوسته ذرت، آرد جو و باگاس استفاده‌شد. از میان سوبستراهای مورد استفاده، سبوس گندم به تولید پروتئاز با بیشترین فعالیت انجامید. فرآیند تخمیر به مدت 120 ساعت انجام شد و میزان پروتئاز تولیدی در فواصل زمانی 24 ساعت مورد بررسی قرار‌گرفت. به منظور بهینه سازی پارامتر‌ها از روش یک متغیر در زمان، استفاده شد واثر عواملی چون دما، pH، رطوبت اولیه، رطوبت کابین، اندازه ذرات، میزان تلقیح و مکمل‌های کربنی و نیتروژنی به منظور تولید آنزیم پروتئاز با بیشترین فعالیت مورد بررسی قرار‌گرفتند. شرایط بهینه برای تولید پروتئاز در بیوراکتور، مدت زمان 48 ساعت ، دمای °C 35 ، رطوبت داخلی 90%، pH برابر 9، اندازه ذرات cm2-1، میزان تلقیح20 % و رطوبت اولیه 200% برای سینی بالایی و 150 %برای سینی میانی بدست آمد. به منظور افزایش تولید آنزیم ار منابع کربنی و نیتروژنی ساده و پیچیده به عنوان مکمل استفاده شد. نتایج نشان‌داد که با غنی‌سازی سوبسترا با سبوس برنج (w/w %1) و آرد ذرت ( w/w%2)، بیشترین فعالیت آنزیم پروتئاز بدست‌آمد. حداکثر فعالیت پروتئاز با استفاده از پوسته گندم، برای سینی بالایی U/gds 1/1281 و سینی پایینی U/gds 7/1048 بدست آمد.
تأثیر دما و pH بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی مورد بررسی قرار گرفت. آنزیم تولیدی در محدوده وسیعی از مقادیر pH فعال بوده و بیشترین میزان فعالیت پروتئاز حاصل از سینی‌های بالا و میانی، در pH برابر 8 حاصل شده‌است. فعالیت نسبی آنزیم در مقادیر pH 9، 10 و 11 به ترتیب 98، 95 و 88% می‌باشد. پروتئاز تولیدی حدود 80% از فعالیت خود را در مقدار pH برابر 13 حفظ کرده‌است. همچنین بررسی نتایج نشان می‌دهد که فعالیت آنزیم تولیدی با افزایش دما افزایش یافته و در دمای C˚65 بیشترین میزان فعالیت پروتئازحاصل شده و پس از آن کاهش یافته است. نتایج نشان داد که پروتئاز تولیدی پایداری خوبی در دامنه وسیعی از مقادیر pH در بازه 4 تا 13 داشته و بیشترین میزان فعالیت در مقدار pH برابر 8 بدست آمد. پایداری پروتئاز تولیدی در بیوراکتور سینی‌دار در مقادیر pH قلیایی بسیار قابل‌توجه بوده بطوریکه آنزیم حاصل از سینی اول و دوم حدود 85% از فعالیت خود را در مقدار pH برابر 13، حفظ کرده‌است.

5-1. نتیجهگیری………………………………………………………… 105
5-2. پیشنهادها ………………………………………………………..107

Abstract

Microbial protease is one of the most important enzymes and represents 60% of total industrial enzyme sale. In this study, protease synthesis in solid state fermentation using B.licheniformis was investigated. Several agricultural residues such as rice bran, sugarcane bagasse, wheat bran, barely bran, corn meal and corn husk were used as substrates. Protease from the wheat bran showed higher activities than other substrates. Effect of extraction parameters such as type and volume of extracted medium and mixing time in shaker were investigated. Maximum recovery of protease obtained with 50 ml of Tris-HCl buffer after 1 hour incubation in the incubator-shaker. Furthermore, the influence of operational parameters such as fermentation time, temperature, pH, initial moisture, cabin humidity, particle size and inoculum level were studied. Results showed that maximum activity of protease was obtained after 48h of incubation, cabin temperature of 35 °C, initial pH of 9, cabin humidity of % 90, particle size in the range of 1-2 cm and initial moisture of % 200 for the top tray and %150 for the middle tray. Moreover, the effect of different carbon and nitrogen supplementary sources for protease production was investigated. Results showed that, maximum protease activity was obtained with supplementation of substrate with rice bran (1% w/w) and corn meal (2% w/w). Maximum protease activities achieved under all of the desired conditions were 1281.1 and 1048.7 U/gds for the top and middle trays respectively. Effect of temperature and pH for protease activity and thermal stability was investigated. The results showed that, the enzyme found to be a typical alkaline protease which was stable in broad temperature range (30-85 ˚C) and pH values (7-13), with maximum activity was defined at 65 ˚C and pH value of 8. Moreover, the application of produced enzyme in leather processing, hydrolysis of gelatin layers of photographic films and also an additive in detergents were investigated. Results showed that, alkaline protease from B. licheniformis, have variety of application in detergent formulation for the remove of stained from cotton cloths, deharing of cow hide and hydrolysis of gelatin layers of photographic films. Also, protease production in two solid state fermentation systems including flask and bioreactor were evaluated. Finally, the protease production in two systems was compared



بلافاصله بعد از پرداخت به ایمیلی که در مرحله بعد وارد میکنید ارسال میشود.


فایل pdf غیر قابل ویرایش

قیمت25000تومان

خرید فایل word

قیمت35000تومان

.