انتخاب صفحه

فهرست مطالب

برای دانلود رایگان قسمت های بیشتراز فایل به انتهای مطلب مراجعه کنید

فصل اول..

امروزه یکی از بزرگ‌ترین چالش‌های بشری تغییرات آب و هوایی زمین و آلودگی محیط زیست ناشی از فعالیت‌های صنعتی است. رها کردن مواد شیمیایی خطرناک و فلزات سنگین ناشی از پساب کارخانه‌های شیمیایی سبب تغییر اکوسیستم می‌شود.

شیمی سبز[1] و نیز توسعه پایدار[2] نظریاتی را پیشنهاد می‌کند که گرایش به آن‌ها تولید محصولات خطرناک و سمی را کاهش می‌دهد و یا کاملاً حذف می‌نماید و در نتیجه سبب تولید کم‌تر ضایعات و مصرف بهینه انرژی می‌شود.استفاده از ابزارهای مدرن از جمله علم بیوتکنولوژی در جهت گسترش فرایندهای دوستدار محیط زیست و تولید محصولات زیست شیمایی یکی از راه کارهای گرایش به شیمی سبز و توسعه پایدار است.استفاده بیوکاتالیست‌ها شامل آنزیم‌ها و یا کل سلول(به عنوان منبع آنزیمی و یا سیستم تولیدی آنزیم)جهت دست‌یابی به فرایندهای اقتصادی و دوست دار محیط زیست کاملاً با قوانین شیمی سبز در جهت کاهش آلودگی‌های زیست محیطی هماهنگی دارد.

      پیشینه استفاده از فرآیندهای آنزیمی را می‌توان در تمدن‌های باستانی بررسی کرد. امروز، نزدیک به 4000 آنزیم شناخته شده است، و از این تعداد، حدود 200 آنزیم در مقیاس تجاری تولید شده‌اند. اکثر آنزیم‌های صنعتی منشأ میکروبی دارند. تا دهه 1960، کل درآمد سالانه فروش آنزیم چند میلیون دلار بود، با افزایش علم در زمینه تولیدات بیو‌شیمیایی، فرآیندهای تخمیری و روش‌های بازیابی، تعداد گسترده‌ای از این آنزیم‌ها به صورت مقرون به صرفه تولیدشده‌اند. بنابراین رشد چشمگیری در بازار آنزیم تجاری مشاهده شد[1].گسترش علم تکنولوژی آنزیم، موفقیت مهمی در صنعت بیوتکنولوژی به شمار می‌آید. بر طبق آمار شرکت نوآزایم[3] «این شرکت در طی سال‌های متوالی% 47 سهم فروش آنزیم‌های صنعتی در سراسر جهان را دارا است و در سال 2012 با رشد % 7 نسبت به سال گذشته، فروش سالانه‌ای، تقریباً معادل با 1/984 میلیارد دلار آمریکا را گزارش کرده است»[2]، این مهم بیان گر اهمیت و کاربرد روز افزون محصولات آنزیمی در سطح جهانی است. سهم عمده‌ای از بازار آنزیم‌های صنعتی متعلق به آنزیم‌های هیدرولیتیک[4] مانند پروتئازها، آمیلازها، آمیدازها، استرازها و لیپازها است.در سال‌های اخیر، لیپاز (تری آسیل گلیسیرول آسیل هیدرولاز، 3.1.1.3EC.) به خواص چند وجهی خود که کارایی‌های گسترده در صنایع مختلف از جمله در صنایع شوینده، مواد غذایی و طعم دهنده، دارویی، آرایشی و بهداشتی، تولید مشتقات استرها و آمینو اسیدها، تولید مواد شیمیایی کشاورزی و پلیمرهای زیستی، تولید محصولات روغنی شیمایی ارزشمند، تفکیک مخلوط‌های راسمیک، ابزارهای تشخیص و سایر کاربردهای پزشکی، صنایع چرم، پارچه و کاغذ سازی، تصفیه فاضلاب و آلاینده‌های نفتی، تولید سوخت زیستی، حسگرهای زیستی و غیره، به عنوان یک آنزیم کلیدی در صنایع بیوتکنولوژی به سرعت در حال پیشرفت است.آنزیم لیپاز عضو طبقه هیدرولازها به شمار می‌رود که در محیط آبی بر روی باندهای کربوکسیلیک استری، حاضر درتری گلیسیریدها، جهت آزاد سازی اسید چرب آزاد و گلیسیرول عمل می‌کنند. سوبسترای طبیعی لیپازها تری گلیسیریدهای زنجیره بلند هستند که حلالیت اندکی در محیط آبی دارند؛ بنابراین واکنش در سطح مشترک آب و لیپید رخ می‌دهد در محیط آلی در حضور مقدار اندک آب، لیپازها توانایی یگانه‌ای را در کاتالیز واکنش عکس (واکنش‌های سنتز استر[5] و انتقال گروه‌های آلی از یک الکل، اسید، آمید و یا یک استر به استری دیگر[6]) از خود بروز می‌دهند. بنابراین با وجود عملکرد اختصاصی بالای این آنزیم به علت جایگاه فعال اختصاصی از جهت شیمیایی، فضایی و مکانی دارای گستره وسیعی از سوبستراها می‌باشد[3].به علت حضور گسترده لیپیدها در طبیعت، آنزیم لیپاز در اکثر جانداران به صورت طبیعی تولید می‌شود. از میان منابع حیوانی ، گیاهی و میکروارگانیسم‌ها؛ آنزیم لیپاز تولیدی توسط منابع میکروبی؛ قارچی و باکتریایی کاربرد گسترده‌ای در زمینه‌های بیوتکنولوژی و شیمی آلی از خود نشان داده‌اند [4].

قارچ‌های رشته‌ای پتانسیل بسیار بالایی جهت تولید انواع لیپازهای خارج سلولی از خود نشان داده‌اند. آنزیم‌های خارج سلولی معمولاً به فرم خالص تهیه و استفاده می‌شوند.با این وجود کاربرد عملی این آنزیم‌ها به علت محدودیت‌های اقتصادی ناشی از پیچیدگی عملیات خالص سازی و عدم پایداری آن‌ها به صنایع خاص محدود شده است[5].از این رو لیپازهای درون سلولی(متصل به غشا سلولی) به جهت کاتالیز اختصاصی‌تر و گزینش پذیری بیشتر نسبت به نوع خارج سلولی و نیز عدم نیاز به  مراحل پیچیده بازیابی آنزیم، تخلیص و تثبیت آنزیم، توجه بیشتری را به خود جلب نموده‌اند[6]. سادگی عملکرد و کاهش هزینه سلول‌های قارچی خشک شده سبب استفاده مستقیم آن‌ها در واکنش‌های هیدرولیز و سنتز استر است که از اهمیت ویژه در مصارف صنعتی برخوردار خواهد بود. با این وجود  به دلیل پایین بودن فعالیت ویژه استفاده از آن‌ها  همچنان محدود شده است[7]. فعالیت ویژه پایین توده زیستی را می‌توان به میزان کم آنزیم درون سلولی در مقایسه با جرم توده سلولی و یا غیر فعال شدن این آنزیم نسبت داد.جهت افزایش بهبود فعالیت سلول و آنزیم درون سلولی تلاش‌های زیادی جهت افزایش میزان تولید آنزیم و کاهش ترشح آن به خارج از سلول و حفظ فعالیت آن صورت گرفته است. بر طبق مطالعات صورت گرفته تولید و ترشح آنزیم تابعیت فاکتورهایی مانند زمان ،دما،سرعت شیکر، pH و نوع و مقدار سوبسترا محیط کشت سلول و همچنین مورفولوژی رشد سلول خواهد داشت[8].

 بیودیزل به عنوان یک جایگزین مناسب برای سوخت‌های فسیلی از طریق بهبود مشکلات اقتصادی ،زیست محیطی و اجتماعی سوخت‌های فسیلی یکی از سرفصل‌های مهم در مطالعات اخیر است.از جمله معایب بیودیزل می‌توان به ویسکوزیته بالای آن نسبت به سوخت‌های فسیلی اشاره کرد. موتورهای دیزلی جدید با سیستم سوخت رسانی تزریقی، نسبت به تغییرات ویسکوزیته سوخت حساسیت دارند از این رو کاهش ویسکوزیته سوخت یک راه حل مناسب جهت حل این مشکل است.در میان استرهای تجاری تولید شده 1-بوتیل-اولئات کارایی گسترده‌ای در زمینه افزودنی‌های سوخت‌های دیزلی دارد و سبب کاهش ویسکوزیته سوخت می‌شود. همچنین از سایر موارد کاربرد آن می‌توان به روان سازی پلی وینیل کلرید (PVC)[7]، عامل مقاوم در برابر آب و سایر سیال‌های هیدرولیک اشاره کرد[9].

در سال‌های اخیر استفاده از بیوتکنولوژی در سنتز استرها با توجه به معایب روش شیمیایی، توجه زیادی را به خود جلب نموده است. معایبی از جمله استفاده از کاتالیزگر های اسیدی و نیازمندی به فرایندهای بالادستی پرهزینه، زمان طولانی، دمای بالا و بازدهی پایین در روش شیمیایی قابل توجه است که با استفاده از فرایندهای بیوتکنولوژی که تحت شرایط متعادل زیستی  و با عملکرد اختصاصی بر سوبسترا رخ می‌دهند برطرف خواهند شد.با این وجود به علت هزینه بالا آنزیم‌ها و همچنین پایداری محدود آن‌ها در شرایط واکنش استفاده از آن‌ها در صنعت محدود شده است. بنابراین عمده چالش در بهینه سازی شرایط واکنش جهت پایداری آنزیم ،دست‌یابی به بازده بالا و نیز یافتن فرایندهایی جهت تولید محصولاتی با ارزش‌تر نسبت به فرایندهای سنتی شیمیایی است.در این مطالعه، سنتز آنزیمی استر 1-بوتیل اولئات توسط سلول‌های قارچی رایزوپوس اوریزا، تثبیت شده بر پایه لوفا در سیستم بسته انجام شد.در فاز اول مطالعه پس از کشت به فرم آزاد و رسم منحنی رشد، زمان فاز لگاریتمی مشخص شد.در فاز لگاریتمی رشد سلول، آنزیم مدنظر جهت تغذیه سلول در حال ترشح است. سپس فعالیت این آنزیم در زمان‌های مختلف فاز لگاریتمی محاسبه و مقایسه فعالیت فرم آزاد و فرم تثبیت یافته سلول قارچی رایزوپوس اوریزا بر پایه لوفا انجام شد و زمان کشت مناسب جهت دست‌یابی به ماکزیمم فعالیت درون سلولی سنتزی و آبکافت و حداقل فعالیت خارج سلولی حاصل شد.در فاز دوم پس از حاصل شدن زمان کشت بهینه و ماکزیمم فعالیت، از سلول‌های تثبیت یافته بر لوفا جهت بهینه سازی پارامترهای موثر بر سنتز استر 1-بوتیل اولئات استفاده شد. پارامترهای مورد بررسی در این مطالعه از جمله سنتز استر در حضور و عدم حضور حلال،اثر محدودیت‌های انتقال جرمی بر بازده و سرعت واکنش در این سیستم‌ها، غلظت سوبسترا،زمان واکنش برای رسیدن به حداکثر بازده ،حذف آب حاصل از واکنش به عنوان محصول ثانویه که سبب بازگشت واکنش تعادلی می‌شود توسط غربال‌های مولکولی[8]، مقدار آنزیم(توده سلولی) و نیز تعداد سیکل‌های امکان استفاده از بیوکاتالیست سلولی  بررسی گردید.

 

1    مقدمه…………………………………………………………………………….. 2

فصل دوم.

در فصل حاضر مفاهیم آنزیمی و به صورت اختصاصی آنزیم لیپاز  بررسی شده است. پس از مطالعه ویژگی‌های خاص آنزیم لیپاز و واکنش‌های آن، منابع تولیدی آنزیم مورد بررسی قرار گرفت و سپس روش‌های تثبیت و انتخاب نگاه‌دارنده سلولی ارائه شد. سنتز استر به عنوان کاربرد برگزیده آنزیم لیپاز در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفت و پارامترهای موثر بر آن معرفی شد. و در ادامه زمینه‌های کاربردی استر 1-بوتیل اولئات معرفی شده است.

1.1        آنزیم

واژه کاتالیست به موادی اطلاق می‌شود که بدون مصرف در طی واکنش شیمیایی از طریق ایجاد پیوند با مواد واکنش دهنده مسیر واکنش را تغییر و در نتیجه سبب کاهش انرژی مورد نیاز جهت انجام واکنش و افزایش سرعت می‌شوند.«شکل 2-1» نحوه عملکرد کاتالیست در تغییر مسیر واکنش را به تصویر می‌کشد
بدون شک واکنش‌های زیادی که در طبیعت رخ می‌دهند نیز از حضور کاتالیست ها بی بهره نیستند. ترکیبات پروتئینی که در سیستم‌های زیستی به عنوان کاتالیست عمل می‌کنند تحت عنوان آنزیم شناخته می‌شوند. آنزیم‌ها دارای جایگاه فعال جهت عملکرد در واکنش هستند که ترتیب آمینو اسیدیخاص جهت پذیرش واکنش دهنده‌ای خاص(سوبسترا خاص) خاص دارند. که از طریق ایجاد کمپلکس با سوبسترا سبب کاهش انرژی و افزایش سرعت واکنش و در نتیجه تولید محصول خواهند شد.

 شناسایی واکنش‌های تبدیل زیستی[1] به زمان پاستور باز می‌گردد و نیز اولین تبدیل زیستی میکروبی در صنعت در دهه 1950 و از طریق بهبود خواص استروییدها انجام شد. واکنش‌های تبدیل زیستی  به واکنش‌هایی اطلاق می‌شود که توسط سلول‌های در حال رشد ، سلول‌های که رشد نمی‌کنند(به بیان ساده‌تر سلول‌های در حال خواب[2]) و یا آنزیم‌های خالص سازی شده کاتالیز می‌شوند.از آغاز قرن گذشته بیوکاتالیست‌ها در تولیدات صنعتی، از جمله فرایند تولید دارو و صنایع غذایی به کار گرفته شدند. جدول پیوست _1 برگرفته از کتاب کاتالیست های آنزیمی در سنتز مواد آلی نوشته دوراز و والدمن [3]در سال 2012  تاریخچه‌ای از کاربرد آنزیم و کاربردهای آن را  تا قرن حاضر  را بیان می‌کند[10]. بر طبق بررسی‌های صورت گرفته ، چهار پیشرفت اساسی در تاریخ بیوتکنولوژی مطالعات در زمینه تبدیلات زیستی را متحول ساخته است[11]:

  1. توانایی جداسازی آنزیم در مقیاس بالا
  2. تثبیت آنزیم و سلول
  3. ظهور تکنولوژی DNA نوترکیب
  4. پیشرفت سیستم‌های دو فازی بیوکاتالیستی

1.1        آنزیم لیپاز

لیپیدها از مواد ضروری در سیستم‌های زنده به شمار می‌روند که از آن‌ها به عنوان تواناترین مولکول‌ها، در ذخیره انرژی نام برده می‌شود. همچنین نقش اساسی در ساختارهای غشایی و انتقال سیگنال‌های پدیده‌های درون سلولی دارند. مشارکت لیپیدها در این فرایندها نیازمند آنزیم‌هایی از جمله لیپاز و استراز دارد که نقش کلیدی در متابولیسم چربی و هضم آن بازی می‌کنند[12].

جهت بررسی یک آنزیم بهتر است ابتدا به طبقه بندی آنزیمی و شناسایی جایگاه آنزیم در آن پرداخت. «شکل2-3» بیانگر جایگاه آنزیم لیپاز بر اساس طبقه بندی اتحادیه بین‌المللی بیوشیمی و بیولوژی زیستی است [4] . هیدرولازها دسته سوم از طبقه بندی شش‌گانه آنزیمی هستند که با افزودن مولکول آب به پیوندهای شیمیایی سبب گسستن پیوند می‌شوند. به علت گستردگی لیپیدها در عالم حیات گروه اول هیدرولازها ،استرازها از اهمیت ویژه برخوردارند. استرازها توانایی عملکرد بر روی باندهای الکلی و هم چنین اسیدی را دارند.

 

مروری بر مفاهیم و مطالعات انجام شده………………………………………….. 7

2    پیش گفتار……………………………………………………………………….. 8

2.1   آنزیم……………………………………………………………………………. 8

2.2   تاریخچه آنزیم………………………………………………………………….. 9

2.3   آنزیم لیپاز…………………………………………………………………….. 10

2.4   تفاوت آنزیم لیپاز و کربوکسیل استراز ……………………………………..11

2.5   علل افزایش توجه محققان به آنزیم لیپاز………………………………… 12

2.6    واکنش‌های آنزیم لیپاز……………………………………………………. 13

2.7   ویژگی‌های آنزیم لیپاز……………………………………………………… 15

2.7.1   خاصیت ساختاری (حضور درپوش بر جایگاه فعال) …………………….15

2.7.2   فعال سازی سطحی…………………………………………………… 16

2.7.3   گزینش پذیری سوبسترا……………………………………………….. 17

2.7.4   مقاومت در برابر افزایش دما  و تغییرات(pH) ………………………..21

2.8   تولید آنزیم لیپاز …………………………………………………………….21

2.8.1   منابع تولید آنزیم لیپاز…………………………………………………. 21

2.8.2   مقایسه لیپازهای باکتریایی و قارچی و کاربردهای آن‌ها ………….23

2.8.3   لیپازهای قارچ‌های رشته‌ای…………………………………………. 24

2.8.4   جداسازی آنزیم‌ها ………………………………………………………25

2.8.5  رشد میکروارگانیسم و القا آنزیم……………………………………… 29

2.9   تثبیت سلولی……………………………………………………………. 30

2.9.1   مقایسه مزایا و معایب  تثبیت آنزیم و سلول………………………. 31

2.9.2   کاربری آنزیم یا سلول تثبیت یافته…………………………………. 32

2.9.3  روش‌های تثبیت سلول……………………………………………… 33

2.9.4   انتخاب نگاه‌دارنده و روش به منظور تثبیت سلولی……………. 40

2.9.5   مکانیسم تراوشی و جایگاه لیپاز در سلولی قارچ رایزوپوس اوریزا و اثر تثبیت بر تراوش آن…………………………………………………………………………….. 46

2.10 روش‌های سنجش فعالیت آنزیم لیپاز…………………………….. 49

2.10.1 روش‌های سنجش فعالیت آبکافت آنزیم لیپاز…………………. 49

2.10.2 روش‌های سنجش فعالیت سنتزی آنزیم لیپاز………………… 49

2.11 کاربردهای آنزیم لیپاز………………………………………………. 51

2.12 واکنش‌های سنتز استر…………………………………………… 52

2.12.1 پارامترهای موثر بر پیشرفت واکنش سنتز استر…………….. 55

2.12.2 سنتز استر 1-بوتیل اولئات……………………………………… 58

فصل سوم.

شناسایی اسیدهای چرب آزاد به روش کدورت سنجی با  استفاده از محلول نمک‌های مس به عنوان معرف، بعد از روش تیترسنجی یک روش معمول مورد استفاده در مطالعات است. این روش نسبت به روش تیترسنجی از دقت بسیار بالایی برخوردار است[83]. در روش تیتر سنجی حضور ناخالصی بروز خطا خواهد شد.این در حالی است که در روش کدورت سنجی فقط اسیدهای چرب آزاد توانایی ایجاد رنگ مورد نظر را خواهند داشت. همچنین دخالت انسان در روش تیتر سنجی و نیز استفاده از محلول‌های بسیار رقیق جهت سنجش اسیدهای چرب ضعیف، از دقت این روش  نسبت به روش کدورت سنجی می‌کاهد[49]. کمپلکس تشکیل شده از مس و اسیدهای چرب آزاد با ایجاد رنگ سبز در حلال آلی قابل شناسایی است.از جمله عوامل موثر در نتیجه این آزمایش غلظت، pH ، مقدار محلول استات مس پیریدن ، نوع حلال آلی  و اسید چرب آزاد مورد سنجش است[85].

منحنی استاندارد  با استفاده از روش سنجش اسید چرب در مرجع [52]  ترسیم شده است. غلظت‌های 5µmol-50µmol اولئیک اسید در 5mL ایزواکتان تهیه و سپس 1mL محلول استات مس-پریدین  به آن اضافه شد .سپس به مدت 90 ثانیه توسط ورتکس میکسر به شدت هم زده و برای مدت 20 ثانیه به حالت ثابت نگه داشته می‌شود تا ذرات واکنش نداده ته نشین شوند «شکل (3-9)». سپس توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 715 نانومتر مقدار میکرو مول اسید چرب باقی مانده در محلول که با استات مس کمپلکس تشکیل داده در مقابل نمونه شاهد ایزواکتان بدون اسید چرب سنجش می‌شود.سپس منحنی استاندارد برای غلظت‌های مختلف بر حسب جذب خوانده شده رسم می‌شود

جهت تایید جنس محصول تولیدی و تعیین دقت روش سنجش کدورت سنجی که در حین آزمایش‌ها به عنوان روش سنجش مورد استفاده قرار گرفته است یک نمونه از استر تولیدی با استفاده از دستگاه GC-Mass سنجش شد. بر طبق گزارش الحاقی در پیوست_ 2 و 3 پایان نامه محصول تولیدی با مقایسه با کتابخانه«Wiley 7n.1» استر 1- بوتیل اولئات97%  تطابق گزارش شده است هم چنین3 پیک در تصویر مشاهده می‌شود که پیک بلند در زمان 13/25minمربوط به محصول مورد نظر است. پیک اول در زمان 11/48 min بوتیل استر اسید چرب و پیک دوم با تطابق %47 درصد هگزانال معرفی شده که احتمالاً به علت آلودگی دستگاه وارد تصویر شده است و کتابخانه قادر به شناسایی دقیق آن نیست. بر طبق سنجش انجام شده اولئیک اسید در محصول گزارش نشده است. این امر بیان گر درصد بالای تبدیل انجام شده است.برنامه خروج محصول از ستون به صورت زیر تنظیم شد. ستون پس از min2 ماندگاری در دمای C°160  با سرعت °C/min 8 به دمای C°300 رسید سپس برای زمان min 10در این دما باقی می‌ماند. دمای تزریق کننده[1] و دتکتور[2]  C°250 قرار گرفت. محصول تولیدی در زمان 13/25 min از ستون خارج شد.

انتخاب سیستم واکنشی سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور و عدم حضور حلال

یکی از روش‌های پیشنهادی برای کاهش انتقال جرم سیستم، اضافه نمودن حلال به سیستم‌های بدون حلال است. بسیاری از منابع مطالعاتی  نرمال هگزان را به عنوان یک حلال آلی مناسب با 3/5 log P= برای سیستم‌های سنتز استر، معرفی کرده‌اند. هم چنین نرمال هگزان در دمای C °37 (دمای واکنش در حضور حلال) فراریت کمی دارد.

1.1.1         سنتز استر 1­- بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان

سنتز استر 1-بوتیل اولئات در محیط شامل اولئیک اسید و 1-بوتانول؛ با نسبت مولی 1:1؛ در 10 mL هگزان به عنوان حلال در ظرف درب دار 20 mL در دمای37 °C  و دور 250 rpm در حضور دو لوفا انجام شد. جهت بررسی پیشرفت واکنش با گذشت زمان، در هر بار نمونه گیری 20µL از محلول واکنش آنالیز شد. آنالیز پیشروی واکنش از طریق روش کدورت سنجی اسید چرب آزاد توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 715 nm صورت گرفت. واکنش حداقل 2 بار تکرار شد و عدد گزارش شده میانگین دو عدد بدست آمده است. بازده واکنش بعد از 9 ساعت و سرعت اولیه بعد از 3 ساعت محاسبه شده است.واکنش تا زمان 30 ساعت ادامه و بازده محاسبه شده است.

1.1.2       سنتز استر 1- بوتیل اولئات در عدم حضور حلال

سنتز استر 1-بوتیل اولئات در محیط واکنش شامل3mL از اولئیک اسید و 1-بوتانول با نسبت مولی 1:1در ظرف در پیچ دار 20mL ، در دمای50 °C  در حضور 1 عدد لوفا انجام شد. جهت بررسی پیشرفت واکنش با گذشت زمان، در هر بار نمونه گیری 20µL از محلول واکنش آنالیز شد. واکنش حداقل 2 بار تکرار شد و عدد گزارش شده میانگین دو عدد بدست آمده است. بازده واکنش بعد از9hr  و سرعت اولیه بعد از 1/5hr محاسبه شده است. سپس کارایی دو سیستم (حلال و عدم حضور حلال) مقایسه شد.

1.1.3      مقایسه اثر محدودیت‌های انتقال جرمی درون قطعه لوفا، بر سرعت اولیه واکنش در حضور حلال و عدم حضور حلال

سرعت واکنش و سرعت انتقال جرم در سیستم‌های هتروژن مستقل از یکدیگر نیستند. سرعت انتقال جرم به گرادیان غلطت سوبسترا در سیستم مرتبط است و گرادیان غلظت تابعیت سرعت حذف سوبسترا توسط بیوکاتالیست رابطه مستقیم دارد. در صورتی که سرعت انجام واکنش کند باشد حتی در صورت وجود محدودیت‌های انتقال جرمی امکان دارد انتقال جرم صورت گرفته جهت تأمین سوبسترا کافی باشد در این صورت سرعت واکنش مستقل از انتقال جرم خارجی است.همچنین اگر سرعت واکنش بالا باشد احتمال این که سرعت انتقال جرم محدود کننده  سرعت واکنش باشد نیز وجود دارد.در این صورت سرعت واکنش به شدت تابعیت انتقال جرم خواهد داشت[87].

1.1.3.1       محاسبه ضریب تأثیر انتقال جرم درون پایه تثبیت

جهت محاسبه اثر محدودیت‌های انتقال جرم درونی بر سرعت واکنش در سیستم‌های کاتالیستی هتروژن، ضریب تأثیر پایه تثبیت محاسبه می‌شود. ضریب تأثیر (ɳ) بر طبق رابطه 5  عبارت است از نسبت سرعت واکنش با وجود محدودیت‌های نفوذی (سرعت نفوذ[3]RWMT) به سرعت واکنش بدون محدودیت‌های نفوذی اگر مقدار (1>ɳ) تبدیل آنزیمی محدود به نفوذ است.در حالی که اگر(1≈ɳ) تبدیل آنزیمی توسط سرعت واکنش محدود می‌شود و محدودیت‌های نفوذی قابل اغماض می‌باشد. در حضور محدودیت‌های نفوذی مقدار ثابت‌های سرعت مقادیر واقعی نیستند و برای محاسبه مقادیر واقعی باید مقاومت‌های نفوذی از سیستم حذف شود. حذف این مقاومت‌ها با ایجاد جریان با درهمی بیشتر،استفاده از ذرات ریزتر و غلظت‌های بالاتر سوبسترا صورت می‌گیرد[86]،[7].

1.1.3.1.1      بررسی اثر انتقال جرم درون قطعه لوفا بر سرعت اولیه واکنش در عدم حضور حلال

جهت بررسی سرعت نفوذ داخل پایه تثبیت برای یک قطعه لوفا ، از روش کاهش اندازه ذرات  جهت حذف محدودیت انتقال جرمی استفاده شد. از یک نمونه کشت تعدادی 10قطعه  لوفا را توسط آسیاب به قطعات کاملاً ریز تبدیل کرده تا پارامتر انتقال جرم داخلی تا حد امکان حذف شود. سپس از آن‌ها جهت انجام واکنش در محیط بدون حلال استفاده شد. و با استفاده از رابطه (5) پارامتر موثر انتقال جرم «ɳ» محاسبه شد.

مواد و روش‌ها……………………………………………………………. 66

3   پیش گفتار…………………………………………………………… 67

3.1   مواد شیمیایی……………………………………………………. 67

3.2   وسایل و دستگاه‌های مورد استفاده…………………………. 68

3.3   میکروارگانیسم………………………………………………….. 69

3.4   شرح انجام آزمایش‌ها ……………………………………………70

3.4.1   کشت جامد میکروارگانیسم…………………………………. 70

3.4.2   تولید محلول اسپور قارچ………………………………………… 70

3.4.3   کشت مایع میکروارگانیسم………………………………….. 72

3.5   تهیه بیوکاتالیست سلولی……………………………………… 72

3.5.1   اسفنج لوفا به عنوان نگاه‌دارنده سلولی………………….. 72

3.5.2   تثبیت قارچ رایزوپوس اوریزا و تهیه بیوکاتالیست………….. 72

3.5.3   تعیین میزان آب بیوکاتالیست سلولی……………………… 75

3.6    رسم منحنی رشد میکروارگانیسم رایزوپوس اوریزا  به فرم آزاد. 75

3.7   فعال سازی غربال‌های مولکولی…………………………….. 76

3.8   روش کدورت سنجی سنجش اسیدهای چرب آزاد………… 76

3.8.1   تهیه محلول معرف استات مس- پیریدین………………….. 77

3.8.2   رسم منحنی استاندارد جذب اسید چرب آزاد جهت سنجش فعالیت استریفیکاسیون……………………………………………………….. 77

3.9   سنجش فعالیت ویژه آنزیم…………………………………….. 78

3.9.1   فعالیت سنتزی سیستم آنزیمی(بیوکاتالیست سلولی)-تولید استر. 79

3.9.2   فعالیت آبکافتی سیستم آنزیمی(بیوکاتالیست سلولی)……………………………………………………………….80

3.10 واکنش سنتز استر 1-بوتیل اولئات………………………….. 80

3.10.1 آنالیز جهت تعیین پیشرفت واکنش………………………. 81

3.10.2 آنالیز محصول تولیدی به روش کروماتوگرافی گازی- اسپکتروسکپی جرمی.. 81

3.11 انتخاب سیستم واکنشی سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور و عدم حضور حلال.. 82

3.11.1 سنتز استر 1- بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان………. 82

3.11.2 سنتز استر 1- بوتیل اولئات در عدم حضور حلال…………. 83

3.11.3 مقایسه اثر محدودیت‌های انتقال جرمی درون قطعه لوفا، بر سرعت اولیه واکنش در حضور حلال و عدم حضور حلال……………………………………. 83

3.12 بهینه سازی شرایط واکنش سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان.. 87

3.12.1 بررسی اثر نسبت مولی حلال به سوبسترا بر بازدهی و سرعت واکنش…. 87

3.12.2 بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا الکلی……………. 87

3.12.3 سوبسترای اسیدی……………………………………….. 87

3.12.4 بررسی اثر غلظت کاتالیست بر بازدهی و سرعت اولیه واکنش……………………………………………………………… 88

3.12.1 بررسی اثر حذف آب بر بازده واکنش………………….. 88

3.12.2 بررسی تغییرات بازده در استفاده پی‌درپی از بیوکاتالیست سلولی………………………………………………………….. 89

برای دانلود رایگان قسمت های بیشتراز فایل به انتهای مطلب مراجعه کنید

فصل چهارم.

در فصل پیش رو به توصیف و تحلیل داده‌های حاصل از آزمایش‌های انجام شده پرداخته شده است. منحنی رشد میکروارگانیسم ترسیم ؛ و میزان فعالیت سنتزی و آبکافتی آنزیم لیپاز بر حسب زمان کشت  و برای دو فرم تثبیت یافته و آزاد مقایسه شد .پس از انتخاب زمان کشت مناسب برای دست‌یابی به حداکثر فعالیت بیوکاتالیست سلولی ، واکنش سنتز استر 1- بوتیل اولئات در حضور و عدم حضور حلال  بررسی، و فاکتور موثر انتقال جرم درون پایه تثبیت برای دو سیستم مذکور ارائه شد. سپس اثر افزایش دما و سرعت چرخش محلول واکنش، بر سرعت اولیه واکنش مطالعه گردید. پس از دست‌یابی به سیستم واکنش مناسب جهت سنتز استر 1-بوتیل اولئات پارامترهای موثر در سنتز  استر از جمله غلظت سوبسترا، میزان آنزیم ، اثر حذف آب در واکنش  سنتزی ، اثر افزایش غلظت یک سوبسترا در حضور مقدار ثابت از سوبسترای دیگر بهینه شد و در پایان بازدهی واکنش ، در استفاده پی در پی بیوکاتالیست تولیدی در  سیستم مورد نظر مطالعه شد.

نتایج و تحلیل ها………………………………………………….. 90

4    پیش گفتار…………………………………………………….. 91

4.1   منحنی رشد رایزوپوس اوریزا……………………………… 91

4.2   بررسی و مقایسه فعالیت بیوکاتالیست سلولی به فرم آزاد و تثبیت یافته. ……………………………………………………………………….92

4.2.1   فعالیت آبکافتی سیستم آنزیمی (بیوکاتالیست سلولی)…………………………………………………………… 92

4.2.2   فعالیت سنتزی سیستم آنزیمی (بیوکاتالیست سلولی)- تولید استر………………………………………………………………. 95

4.3   انتخاب سیستم واکنشی سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور و عدم حضور حلال………………………………………………………………. 97

4.3.1   سنتز استر 1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان… 97

4.3.2   سنتز استر 1-بوتیل اولئات در عدم حضور حلال…… 98

4.3.3   مقایسه پارامتر انتقال جرم درونی قطعه لوفا در حضور و عدم حضور حلال…………………………………………………………….. 99

4.4   بهینه سازی شرایط واکنش سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان…………………………………………………………… 105

4.4.1   بررسی اثر نسبت مولی حلال به سوبسترا بر بازدهی و سرعت واکنش…………………………………………………………… 105

4.4.2   بررسی اثر غلظت کاتالیست بر بازدهی و سرعت اولیه واکنش…………………………………………………………… 107

4.4.3   بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا الکلی………. 108

4.4.4   بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا اسیدی……. 109

4.4.5  بررسی اثر حذف آب بر بازده واکنش……………….. 111

4.4.6   بررسی تغییرات بازده در استفاده پی‌درپی از بیوکاتالیست سلولی…………………………………………………………. 114

نتیجه‌گیری و پیشنهادا………………………………………… 116

5    پیش‌گفتار………………………………………………….. 117

5.1   نتیجه‌گیری………………………………………………. 117

5.2   پیشنهادات جهت مطالعات آتی……………………….. 120

5.2.1   بیوکاتالیست…………………………………………… 120

5.2.2   بستر واکنش…………………………………………… 121

5.2.3   شرایط واکنش………………………………………….. 121

Abstract:

lipase is a carboxylic ester hydrolase enzyme, which acts on triglycerides to release fatty acids, monoglycerides, diglycerides and glycerol .The ability of lipase to catalyzed revers reaction ,esterification, started a vast chapter on this enzyme scientific applications. According to the ability of Rhizopus oryzae fungal cells, producing membrane-bound lipase, to estimate logarithmic duration of growth and optimize lipase production time, microbial growth curve was depicted. While growing was processed during 24-96 hour for immersed and immobilized (within loofa cellulosic matrix) cells, Synthetic and hydrolytic activity of lipase was investigated. Membrane-bound lipase activity which produced by immobilized enzyme reaches its maximum after 48 hour cultivation time. Immobilized cells after 48 hour cultivation, used as biocatalyst for 1-butyl-oleate ester synthesis in a batch system. The efficiency of system was compared in the presence of n-hexane as solvent and solvent free system. Representing 86% efficiency, n-hexane system was chosen for further studies, which improved mass transport and kinetic parameters of esterification reaction. In order to achieve maximum efficiency in minimum time, the parameters influencing ester synthesis reaction in the presence of n- hexane were optimized.1-butyl oleate  synthesis in the presence of1/5 g molecular sieves, 1:1 molar ratio of reactants, 0/3M; higher than 95 % efficiency was gained. Utilizing for 20 consecutive reaction cycle, less than 10 % loss, was observed in reaction yield.



بلافاصله بعد از پرداخت به ایمیلی که در مرحله بعد وارد میکنید ارسال میشود.


فایل pdf غیر قابل ویرایش

قیمت25000تومان

خرید فایل word

قیمت35000تومان