فهرست مطالب

فصل 1: مقدمه

مقدمه

1-1 تاریخچه:
یکی از مراجع و تحقیقات اولیه از میکروسکوپ هایی که می توانند از اصل بازتاب داخلی کلی نور، بین یک محیط غلیظ و رقیق برای ایجاد تصویر استفاده کنند، توسط استونی در سال 1896 ارائه شده است. اگرچه، تا سال 1956 اولین میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی(TIRM) ساخته نشد. در این کار بدوی، آمبروز موفق به ساخت میکروسکوپ تماس سطحی(SCM) شد و آن را برای مطالعه ی اینکه چطور تماس تشکیل شده بوسیله ی سلول ها متحرک، روی رفتار ثانویه آنها اثر میگذارد، استفاده کرد. با استفاده از این پدیده که نور وقتی بازتاب داخلی کلی می شود(برای مثال در سطح تماس شیشه-آب) بصورت جزئی در محیط رقیق تر نفوذ می کند و از این امواج ناپایا می توان برای نور دهی یک قسمت خاص سلول ها که در تماس با سطح هستند، استفاده کرد. به میکروسکوپی که از امواج ناپایا برای برانگیحته کردن مولکول های فلوئورسانس در نمونه استفاده می کند میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی فلوئورسانسی (TIRFM) می گویند. TIRFM همردیف با میکروسکوپ هایی است که در محدوده ی میدان نزدیک، مانند میکروسکوپ تشدید پلاسمون های سطحی (SPR) و میکروسکوپ نوری میدان نزدیک روبشی (NSOM)، کار می کند.
1-2 اصول کارکرد میکروسکوپ TIRF
1-2-1 اصول فلوئورسانسی:
وقتی نور با فرکانس خاصی به اتم می تابد الکترون ها را به حالت برانگیخته می برد. وقتی که الکترون به حالت پایه برمی گردد نوری با فرکانس کمتر تابش می کند. فلوئوروفرها(ماده ای که با آن سلول ها را رنگ آمیزی می کنیم) مولکول هایی هستند که نور فلوئورسانس تابش می کنند، وقتی نور با طول موج مناسب به آنها بتابانیم. در شکل 1 این پدیده را مشاهده می کنیم.

1-3 اصول بازیاب داخلی کلی
وقتی نور ازسطح تماس یک محیط شفاف با ضریب شکست بیشتر و یک محیط با ضریب شکست کمترعبور می کند برای زاویه های بیشتر از زاویه ی بحرانی دچار بازتاب کلی داخلی می شود. اصل بازتاب کلی بر اساس قانون اسنل(Snell)است که با معادله زیر تعریف می شود:

ما از میکروسکوپ TIR با اعمال تغییراتی می توانیم به عنوان میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی فلوئورسانسی(TIRFM) استفاده کنیم. حساسیت این روش برای نشان دادن تغییرات کوچک در نمونه(بافت) بیشتر از TIRM است. اصولا موادی با این روش قابل مشاهده هستند که بطور ذاتی یا غیر ذاتی خاصیت فلوئورسانسی داشته یا خیلی نزدیک سطح تماس و محل تحریک امواج ناپایا باشند. مولکول های مختلف دارای فلوئورسانس خاص خود هستند. از فلوئوروفور(یک ماده ی فلوئورسانس)برای علامت گذاری نمونه استفاده می شود که در هنگام برانگیخته شدن تشعشع می کند. اگرچه فلوئوروفورها که متصل به سطح نمونه هستند و آنهایی که در محیط اطراف هستند در حال تعادل قرار دارند، فلوئورسانس ناشی از مولکول های غیر متصل به نمونه(پشت زمینه) که تعداد آن ها خیلی بیشتر است مانع از مشاهده ی فلوئورسانس ناشی از مولکول های متصل به بافت می شود. در نتیجه تصویری واضح از نمونه نخواهیم داشت. ولی در TIRF با استفاده از امواج ناپایا فقط قسمتی از نمونه را نوردهی می کنیم در نتیجه مولکول های فلوئورسانس حاضر در نمونه که متصل به نمونه نیستند برانگیخته نمی شوند. در نتیجه تصویری واضح از نمونه خواهیم داشت. عمق نفوذ امواج ناپایا در نمونه در حدود 100nm است. پس TIRFM مشاهده ی سطح ناحیه هایی مثل غشای سلولی پایه که در حدود 7.5nm است را ممکن می سازد. اگرچه پهنای ناحیه در حدود چند صد نانومتر است و ناحیه زیر غشای سلولی نیز علاوه برغشای سلولی با روش TIRFM قابل مشاهده می باشد. با این روش خصوصیات و وقایع غشای سلولی درسلول های زنده را می توان با تفکیک محوری بالا مشاهده کرد. از TIRF همچنین برای مشاهده ی فلوئورسانس یک تک مولکول استفاده می شود که آن را تبدیل به ابزاری قدرتمند در بیولوژی و بیوفیزیک می کند.
1-6 پیکربندی میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی فلوئورسانسی:
پیکربندی های میکروسکوپTIRF به دو صورت است. 1) بدون منشور،که در این روش نور از طریق عدسی شیئی به نمونه می تابد. 2) با منشور، که نور از بیرون به نمونه تابیده می شود. در شکل 2 شماتیک این دو روش را مشاهده می کنید.

:چگونگی ایجاد نور فلوئورسانس

:چگونگی ایجاد نور فلوئورسانس

1-1 تاریخچه:………………………………………………………………….. 2
1-2 اصول کارکرد میکروسکوپ TIRF ا………………………………………..2
1-2-1 اصول فلوئورسانسی…………………………………………………… 2
1-3 اصول بازیاب داخلی کلی………………………………………………… 2
1-4 امواج ناپایا…………………………………………………………………. 3
1-5 میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی فلوئورسانسی……………………… 4
1-6 پیکربندی میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی فلوئورسانسی…………… 4
1-8 نکاتی در مورد طراحی سیستم………………………………………… 5

برای دانلود رایگان قسمت های بیشتراز فایل به انتهای مطلب مراجعه کنید

فصل2: مقدمه ای بر انواع میکروسکوپ ها

میکروسکوپ دستگاهی است که برای دیدن اجسام خیلی کوچک بکار می‌رود. با استفاده از آن می‌توان تصویری بسیار بزرگتر و با جزئیات بیشتر از جسم مورد نظر را بدست آورد. میکروسکوپ های مختلف دارای بزرگنمائی های متفاوتی می باشند که عموماً با استفاده از عدسی های گوناگون، تصویر نمونه مورد نظر چند برابر می کنند. اصول کلی در تمامی انواع میکروسکوپ ها براساس عبور نور با طول موج های متفاوت از چندین عدسی محدب می باشد. که هرچقدر طول موج نور بکار رفته در میکروسکوپ مزبور کوتاهتر باشد قدرت تفکیک و یا جداکنندگی آن میکروسکوپ بیشتر است. برای مثال قدرت تفکیک چشم انسان ۱ میلیمتر می باشد و برای میکروسکوپ نوری معمولی ۰.۲۴ میکرون است.
2-2-تاریخچه
در سال ۱۶۵۵، رابرت هوگ که یک فیزیکدان انگلیسی بود، اولین نگرش میکروسکوپی را انجام داد. هوک که ۲۹ سال سن داشت به کمک اولین میکروسکوپ خود توانست بقایای دیواره سلول های مرده گیاهی را در برشی از چوب پنبه ی پوست درخت بلوط مشاهده کند. وی از آنچه دیده بود نقاشی هایی را رسم کرد. به علت شباهت اتاقک های کوچکی که در بافت چوب پنبه با لانه زنبور دیده بود، نام این اتاقک ها را سلول گذاشت. اما هوک در آن زمان نمی دانست که درون این اطاقک ها، ماده زنده ای که امروزه آن را پرتوپلاسم می نامیم وجود داشته است. هوک علاوه بر مشاهده چوب پنبه، اجزاء دیگری از موجودات مثل بال حشرات و چشم مرکب زنبور را هم بررسی کرده بود و نتیجه مشاهدات خود را در کتابی به نام «ذره نگاری» به چاپ رساند.
اما حدود ۲۰ سال بعد و در سال ۱۶۷۴ آنتونی وان لیوون هوک که یک پارچه فروش هلندی بود، برای اولین بار توانست به کمک میکروسکوپ دست ساز خود، تک سلول های زنده (آغازیان جانور مانند یا پروتوزوآها) را ببیند. در سال ۱۶۸۳ هوک با تکمیل میکروسکوپی که ساخته بود، توانست دنیای باکتری ها را نیز کشف کند. ساختار میکروسکوپ ها به آهستگی دستخوش دگرگونی هایی قرار گرفت و قدرت تفکیک آنها بهتر شد. اما ذات انسان از محدودیت بیزار است. میکروسکوپ های معمولی قدرت بزرگنمایی تا حدود ۱۵۰۰ برابر دارند. اما اگر می توانستیم دنیای ریزتر از این را هم ببینیم چقدر بهتر بود. این رویا در سال ۱۹۳۲ با ساخت اولین میکروسکوپ الکترونی به واقعیت پیوست.
در طول قرن هیجدهم میکروسکوپ در زمره وسایل تفریحی به شمار می آمد. با پژوهش های بیشتر پیشرفت های قابل توجهی در شیوه ساختن عدسی شیء حاصل شد. بطوری که عدسی های دیگر بصورت ذره بین های معمولی نبودند بلکه خطاهای موجود در آن ها که به کج نمایی معروف هستند، دفع شده اند. آن ها می توانستند جرئیات یک شیء را دقیق تر نشان دهند. پس از آن در طی پنجاه سال، پژوهشگران بسیاری تلاش کردند تا بر کیفیت و مرغوبیت این وسیله بیفزایند. بالاخره «ارنست آبه» توانست مبنای علمی میزان بزرگنمایی میکروسکوپ را تعریف کند.
بدین ترتیب میزان بزرگنمایی مفید آن بین ۵۰ تا ۲۰۰۰ برابر مشخص شد. البته می توان میکروسکوپ هایی با بزرگنمایی بیش از ۲۰۰۰ برابر ساخت. مثلا قدرت عدسی چشمی را بیشتر کرد. اما قدرت تفکیک نور ثابت است و درنتیجه حتی بزرگنمایی بیشتر نمی تواند دو نقطه از یک شی را بهتر تفکیک کند. هر چه بزرگنمایی شی افزایش یابد به میزان پیچیدگی آن افزوده می شود. بزرگنمایی شیء در میکروسکوپ های تحقیقاتی جدید معمولا ًx۳، x۶، x۱۰، x۱۲، x۴۰ و x۱۰۰ است. در نتیجه بزرگنمایی در این میکروسکوپ بین ۱۸ تا ۱۵۰۰ برابر است. چون بزرگنمایی میکروسکوپ نوری بدلیل وجود محدودیت پراش از محدوده معینی تجاوز نمی کند برای بررسی بسیاری از پدیده هایی که احتیاج به بزرگنمایی زیادی ندارند مفید است. تحقیقات بسیاری صورت گرفت تا وسیله دقیق تری با بزرگنمایی بیشتر ساخته شود. نتیجه این پژوهش ها منجر به ساختن میکروسکوپ الکترونی شد.
2-3-انواع میکروسکوپ از نظر نوع آشکارساز:
در هر میکروسکوپی از روش های متفاوتی برای ایجاد تصویر از نمونه استفاده می شود. مثلا در میکروسکوپ الکترونی از الکترون هایی که به نمونه تابیده می شوند و در میکروسکوپ های پروبی از تغییرات جریان یا ولتاژ و … برای ایجاد تصویر استفاده می کنند. انواع میکروسکوپ ها از این لحاظ عبارتند از:
. میکروسکوپ ماوراء بنفش یا میکروسکوپ UV :
که منبع تغذیه نور، اشعه UV می باشد. نسبت به میکروسکوپ نوری معمولی قدرت تفکیک بالاتری داشته چراکه اشعه ماوراء بنفش طول موج کوتاهتری نسبت به نور مرئی دارد . عدسی شیئی بکار رفته در این میکروسکوپ از جنس کوارتز می باشد. بدلیل مضر بودن اشعه ماوراء بنفش برای چشم انسان، از نمونه عکسبرداری شده و سپس بر روی صفحه مانیتور قابل مشاهده است ( قدرت تفکیک 600 آنگستروم ).
3 – میکروسکوپ فلورسانس :
بطورکلی مواد از لحاظ خاصیت فلورسانس دو نوع هستند :
– فلورسانس اولیه که این مواد ذاتاٌ خاصیت فلورسانس دارند یعنی از خود نور ساطع می کنند مثل ویتامین ها و رنگ ها .
– فلورسانس ثانویه که از خود خاصیت فلورسانسی نداشته و با رنگ آمیزی و معرف های گوناگون از قبیل سولفات بربرین و نارنجی آکریدین خاصیت فلورسانسی را به آنها القاء می کنیم. منبع نور در این میکروسکوپ اشعه UV می باشد. در اینجا نیز از تصویر نمونه عکسبرداری شده که بر روی صفحه مانیتور قابل مشاهده است
4 – میکروسکوپ میدان تاریک :
منبع نور در این نوع میکروسکوپ نور مرئی می باشد و با ایجاد انکسار نور توسط آئینه های محدب و مقعر، شیء یا نمونه مورد بررسی، شفاف و نورانی در زمینه سیاه دیده می شود.
اساس آن همانند میکروسکوپ نوری است با این تفاوت که دیافراگم کندانسور آن به نحوی ساخته شده که بخش میانی آن غیر شفاف و مانع عبور پرتوهای نور مرئی است و نور تنها از کناره های دیافراگم و به طور مایل به جسم می تابد و از پرتوهای نوری که به طور مایل به جسم می رسند تصویر به وجود می آید. هیچ پرتوی مستقیما از جسم نمی گذرد. با میکروسکوپ زمینه سیاه می توان برخی بخش های سلولی را که پایین تر از حد میکروسکوپ معمولی است مشاهده یا عکس برداری کرد.
بیشتر برای مطالعه ریخت شناسی و برخی حرکات سلولی اندامک ها استفاده می شود. پرتوهای محیطی پس از رسیدن به سطح جسم پراش می یابند بنابراین جزئیات ساختمان درونی سلول یا اندامک ها مشخص نخواهد شد. در سلولهای کشت شده که با میکروسکوپ زمینه سیاه بررسی می شوند هسته، میتوکندری، ذرات لیپیدی، پوشش های سلولی (درخشان)، سیتوپلاسم( تیره) دیده می شود.

2-1-مقدمه………………………………………………………………………. 9
2-2-تاریخچه…………………………………………………………………….. 9
2-3-انواع میکروسکوپ از نظر نوع آشکارساز………………………………. 10
2-5-انواع میکروسکوپ های نوری……………………………………………. 11
2-6-پارامترهای اصلی در میکروسکوپها………………………………………. 15
2-7- قدرت تفکیک……………………………………………………………… 15
2-8- تابع پهن شدگی نقطه…………………………………………………. 17
2-9- حد توان تفکیک ابه……………………………………………………… 18

فصل3: میکروسکوپ های پرکاربرد در زیست شناسی و روش های

در این فصل ما به معرفی پرکاربردترین میکروسکوپ ها در زیست شناسی و معرفی مختصر TIRM و TIRFM و تکنیک های دیگر اثز سطحی غیر از TIRM و TIRF می پردازیم. در آخر فصل انواع تکنیک های پروبی روبشی را از ابتدا معرفی می کنیم تا به تکنیک جدیدتر آن که میکروسکوپ نوری میدان نزدیک روبشی(SNOM) است برسیم.
3-2-میکروسکوپی میدان روشن:
معمولا گرفتن تصویر از سلول های زنده با نور عبور کرده از نمونه یا با میکروسکوپ فلوئورسانسی امکان پذیر است. در این تکنیک می توان اطلاعاتی در مورد شکل سلول، موضع و توانایی حرکت آن بدست آورد[5]. تکنیک هایی مثل تباین فاز(PC) و تباین تداخل تفاضلی (DIC) از مشهورترین تکنیک های مورد استفاده در میکروسکوپ های میدان روشن هستند که در بیشتر آزمایشگاهای تحقیقاتی زیستی برای آنالیز سلول ها استفاده می شود. تباین فاز(PC) با تبدیل تغییرات کوچک فاز غیر قابل مشاهده – وقتی نور از میان نمونه می گذرد بوجود می آید – به دامنه یا تغییرات شدت در تصویر کار می کند. این تغییرات در فاز وقتی که نور عبوری از میان نمونه با پرتو مرجع تداخل داده شود به آسانی قابل مشاهده هستند. یکی از مشکلاتی که در میکروسکوپ PC وجود دارد، بوجود آمدن یک هاله اطراف تصویر است، اگرچه با استفاده از میکروسکوپ DIC می توان این مشکل را برطرف کرد.
در DIC، یک نور قطبیده به کمک منشور والستون به دو پرتو با جدایی فضایی تقسیم می شود و از میان نمونه می گذرند. طول مسیر اپتیکی دو پرتو بر اثر تغییرات چگالی اپتیکی(ضریب شکست) هر مسیر متفاوت می شود. بعد از اینکه دو پرتو باهم ترکیب و تداخل کنند، تفاوت فازآن ها موجب ایجاد تصویر تباینی می شود. در شکل 1 شماتیک این نوع میکروسکوپ را مشاهده می کنید. محدویت اساسی میکروسکوپ های میدان روشن برای زیست شناسی سلول های زنده این است که از این روش برای دیدن اجزای خاص کوچک سلول نمی توان استفاده کرد. همچنین ناتوانی آن در گرفتن تصویر از نمونه های زیستی ضخیم است. برای مطالعه ی بر هم کنش های ذرات نانو و سلول، یکی از محدودیت های این روش در پایین بودن توان تفکیک محوری (طولی) آن است، مثلا با این روش نمی توان تعیین کرد که آیا ذره ی نانو درون یا بیرون غشای سلولی است. مزیت اصلی این روش آشکار سازی بدون علامت گذاری نمونه است.
3-3-میکروسکوپی هم کانونی:
میکروسکوپ روبش لیزر هم کانونی (CLSM) در اواخر دهه ی 1980 وارد بازار شد و بزودی موجب افزایش سریع مقالات در زمینه ی زیست سلولی و انتقال دارو شد. CLSM از نور لیزر برای برانگیخته کردن نمونه های نشانه گذاری شده با فلوئورسانس استفاده می کند و نور فلوئورسانس منتشر شده را از طریق لوله های فوتون فزون گر آشکارسازی می کند. با قرار دادن صحیح یک سوراخ کوچک که نور خارج از فاصله ی کانونی را حذف می کند] [6 و اسکن کردن نمونه با نور لیزر کانونی شده در سرتاسر نمونه می توان توان تفکیک محوری بیشتر از آن مقداری که در روش استاندارد میکروسکوپ فلوئورسانسی میدان گسترده وجود دارد، بدست آورد.
از میکروسکوپ هم کانونی غیر لیزری دیسک چرخان برای نور دهی نمونه با بیش از 1000پرتو کوچک نور استفاده می شود. نوردهی با گذشتن پرتو فرودی از میان دیسکی که شامل چندین عدسی کوچک است کار می کند و سپس نور خروجی از نمونه باCCD جمع آوری می شود. دیسک چرخان کانونی بطور کلی برای تصویر برداری از سلول های زنده بهتر است زیرا روش نور دهی امکان تصویر برداری سریع و فوتو بلیچینگ کمتر را نسبت به اسکن میکروسکوپ فراهم می کند. نقطه ضعف اصلی این نوع میکروسکوپ ها این است که پیکربندی آن ها مشکل تر از سیستم با روبش لیزری است و برای آزمایش های فوتو بلیچینگ و فعال سازی نوری نمی توان از آن استفاده کرد.
مشکل اصلی CLSM در مطالعه برهم کنش ذرات نانو و سلول، ناتوانی در تعیین مکان دقیق یک یا چند نقطه ی متفاوت است. بیشترین توان تفکیک محوری CLSM در حدود 500nm و 800nm بترتیب برای سیستم یک فوتونی و دو فوتونی است. این نقاط ممکن است به عنوان مثال یک ذره نانو و یک جسم باشد که با فلوئورسنت علامت گذاری شده باشد. در این مورد مشکل بتوان از فاصله ی دقیق ذره و جسم علامت گذاری شده مطمئن شد. این مشکل برای تمام روش های میکروسکوپی فلوئورسانسی وجود دارد اگرچه تکنیک هایی مثل میکروسکوپی بازتاب داخلی کلی فلوئورسانسی دارای توان تفکیک محوری بهتری هستند که در فصل های بعد به آن می پردازیم.

شماتیک اپتیکی میکروسکوپ DIC، نور با عبور از منشور والستون به دو پرتو   تقسیم شده که بعدا باهم تداخل داده می شوند.

شماتیک اپتیکی میکروسکوپ DIC، نور با عبور از منشور والستون به دو پرتو تقسیم شده که بعدا باهم تداخل داده می شوند.

اثر سطحی SPR و پروبی روبشی…………………………………………… 20
3-1-مقدمه…………………………………………………………………….. 21
3-2-میکروسکوپی میدان روشن:……………………………………………. 21
3-3-میکروسکوپی هم کانونی……………………………………………….: 22
3-4-میکروسکوپی با تکنیک های امواج ناپایا………………………………… 23
3-4-1-میکروسکوپی تشدید پلاسمون های سطحی………………………. 24
3-4-2-میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی فلوئورسانسی……………………. 28
3-5-میکروسکوپ ها با پروب روبشی…………………………………………. 29
3-5-1تکنیک های مورد استفاده در پروب روبشی…………………………… 29
3-5-2-اساس کار میکروسکوپ با اندازه گر روبشی………………………….. 30
3-5-3-انواع میکروسکوپ های پروبی روبشی………………………………… 31
3-5-3-1-میکروسکوپ تونلی روبشی…………………………………………. 31
3-5-3-2-میکروسکوپ نیروی اتمی……………………………………………. 33
3-5-3-3-دامنه ی کاربرد میکروسکوپ نیروی اتمی………………………… 34
3-5-3-4-میکروسکوپ نیروی الکتریکی………………………………………. 35
3-5-3-5-میکروسکوپ نیروی مغناطیسی………………………………….. 36
3-5-4-میکروسکوپ های نوری میدان نزدیک ……………………………….38
3-5-4-1-نوک ﭘﺮوﺑﻬﺎی SNOM‬ﺑﺮ اﺳﺎس رﺷﺘﻪ ﻧﻮری………………………. 40‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
3-5-4-2-ﺷﻴﻮه« ﻧﻴـﺮو- ﺑﺮﺷـﻲ»روﺷـﻲ ﺑـﺮای ﺗﻨﻈـﻴﻢ ﻓﺎﺻـﻠﻪ
ﭘـﺮوب– ﺳـﻄﺢ در‬ ﻣﻴﻜﺮوﺳﻜﻮپ ﻧﻮری ﻣﻴﺪان- ﻧﺰدﻳﻚ………………………….‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬ 41‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
3-5-4-3-پیکربندی هایی برای سیستمNSOM ا……………………………..43

فصل4: میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی(TRFM) و میکروسکوپ بازتاب داخلی کلیفلوئورسانسی(TIRFM)

در این فصل به معرفی کامل میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی و میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی فلوئورسانسی می پردازیم.
4-2-میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی(TIRM):
یکی از مراجع و تحقیقات اولیه از میکروسکوپ هایی که می توانند از اصل بازتاب داخلی کلی نور بین یک محیط غلیظ و رقیق برای ایجاد تصویر استفاده کنند، توسط استونی در سال 1896 ارائه شده است. اگرچه، تا سال 1956 اولین میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی(TIRM) ساخته نشد. در این کار بدوی، آمبروز موفق به ساخت میکروسکوپ تماس سطحی(SCM) شد و آن را برای مطالعه ی اینکه چطور تماس تشکیل شده بوسیله ی سلول های متحرک روی رفتار ثانویه آنها اثر میگذارد، استفاده کرد. با استفاده از این پدیده که نور وقتی بازتاب داخلی کلی می شود(برای مثال در سطح تماس شیشه-آب) بصورت جزئی در محیط رقیق تر نفوذ می کند و از این امواج ناپایا میتوان برای نور دهی یک قسمت خاص سلول ها که در تماس با سطح هستند استفاده کرد[43].
دو چیدمان برای SCM که توسط آمبروز در سال1961 معرفی شد، در شکل1 نشان داده شده است. در میکروسکوپ با میدان تاریک(شکل1 الف)، نور از یک منبع قوی، مثل لامپ قوسی جیوه، از یک شکاف عبور می کند و به سطح بالایی یک منشور 60 درجه برخورد می کند. نمونه ی سلولی میان اسلاید شیشه ایی (لام) و لامل قرار گرفته است و بوسیله ی روغن با منشور بصورت اپتیکی جفت شده است. همانطور که در قسمت های بعد با جزئیات توضیح داده خواهد شد، وقتی نور با منشور با زاویه ایی بزرگتر از زاویه بحرانی به سطح مشترک شیشه-آب برخورد می کند، منجر به ایجاد امواج ناپایا در محیط رقیق می شود. وقتی سلولی با ضریب شکست بزرگ از آب در سطح مشترک حرکت می کند، ناحیه های نزدیک تر به سطح شیشه وارد میدان امواج ناپایا خواهد شد و نور را پخش و پراکنده می کند، که نشانگر حضور یک ناهمگنی کوچک در ساختارشان است. این اصل اساسی TIRM است. وقتی از بالا دیده شود، میدان بصورت کامل تاریک دیده می شود بجز برای ناحیه های در تماس نزدیک با شیشه بخاطر پاشندگی نور بصورت روشن دیده می شوند. آمبروز همچنین دریافت که با تغییر زاویه ی نور تابشی می توان شکل سلول را فهمید. وقتی که زاویه ی تابش افزایش یابد عمق نفوذ امواج ناپایا کاهش می یابد. این به این معنی است که ناحیه ی سلول که نوردهی می شود کاهش می یابد و در نهایت فقط ناحیه هایی با تماس مولکولی با سطح را می توان مشاهده کرد[43]. آمبروز همچنین نوع میدان روشن از میکروسکوپ تماس سطحی خود را معرفی کرد، شکل 1 ب. در این مورد، نمونه در نور منعکس شده دیده می شود. همان طور که از اسم آن هم معلوم است، میدان دید بطور یکنواخت روشن دیده می شود زمانی که زاویه ی تابش از زاویه ی بحرانی بیشتر می شود اجسام در تماس با شیشه بصورت تاریک دیده می شوند. بطور کلی چیدمان میدان روشن برای بررسی طبیعت تماس هایی که سلول ها با سطح شیشه تشکیل می دهند مناسب تر است. برای مطالعه ی حرکت سلول ها که شامل زمان هایی در حد دقیقه و تغییرات سریع در تماس است، آمبروز بیان داشته است که چیدمان میدان تاریک مناسب تر است[44]. اگرچه هیچ نتایجی برای اثبات حرف خود ارائه نکرده است. اگرچه اصل استفاده از میدان های ناپایا برای مطالعه ی حرکت سلول ها، یک کار زیرکانه از آمبروز بود ولی میکروسکوپ تماس سطحی بطور مداوم استفاده نمی شود. عدم قابلیت بهینه سازی SCM برای کارهای مختلف از جمله اصلی ترین دلایل آن است. اگر تصویری در مقالات علمی چاپ می شد با استفاده از این نوع میکروسکوپ، برای بقیه قضاوت در مورد کیفیت ابزار مورد استفاده مشکل بود. بیشتر تصویرهای کارهای آمبروز، تصاویری شماتیک از مشاهدات او بوده است. تقریبا در همان زمان گسترش SCM، بعضی مخترعان نوعی از میکروسکوپی تداخلی را گسترش دادند. این تکنیک به صورت عمومی بنام های میکروسکوپی تداخلی بازتابی، میکروسکوپی بازتابی تباینی یا میکروسکوپی بازتابی تداخلی تباینی(RICM) شناخته می شود. این نوع میکروسکوپ در دهه های 60 و70 میلادی بشدت برای مطالعه شکل گیری تماس سلول ها با سطح در حال حرکت، مورد استفاده قرار می گرفت[45,46].

شماتیکی از میکروسکوپ سطحی تماسی که توسط آمبروز در سال 1956 ارائه شد. الف)چیدمان میدان تاریک. یک منبع نور(لامپ قوسی جیوه) توسط یک لنز خارجی با زاویه ایی بیشتر از زاویه ی بحرانی از میان شکاف به منشور، کانونی می شود. یک میدان امواج ناپایا در بالای منشور شکل می گیرد و توسط سلول های در میدان، پخش می شود. با قرار دادن میکروسکوپ در بالای منشور می توان این نور را مشاهده کرد. ب)

شماتیکی از میکروسکوپ سطحی تماسی که توسط آمبروز در سال 1956 ارائه شد. الف)چیدمان میدان تاریک. یک منبع نور(لامپ قوسی جیوه) توسط یک لنز خارجی با زاویه ایی بیشتر از زاویه ی بحرانی از میان شکاف به منشور، کانونی می شود. یک میدان امواج ناپایا در بالای منشور شکل می گیرد و توسط سلول های در میدان، پخش می شود. با قرار دادن میکروسکوپ در بالای منشور می توان این نور را مشاهده کرد. ب)

4-1-مقدمه ……………………………………………………………… 48

4-2-میکروسکوپ بازتاب داخلی کلی………………………………… 48
4-3-اصول بازتاب داخلی کلی…………………………………………. 51
4-4-امواج ناپایا………………………………………………………….. 52
4-5-کاربردهای اولیه TIRM ا…………………………………………….55
4-6-TIRM برای اندازه گیری جدایی کلوئیدی……………………….. 55
4-7-چیدمان TRIFM برای اندازه گیری نیرو……………………………. 58
4-8-TIRM تداخلی برای اندازه گیری حرکت کاینزینی………………. 60
4-9-نوردهی با امواج ناپایا ……………………………………………….61
4-9-1-راهبردهای نوردهی TIRM ا……………………………………..62
4-10-توان تفکیک زمانی………………………………………………… 70
4-11-ترکیب تصویر برداریTIRM و میدان روشن…………………….. 70
4-12-عمق میدانی و کانونی………………………………………….. 71
4-13-میکروسکوپ های TIRF ا………………………………………..72
4-14-انواع چیدمان TIRFا………………………………………………. 76
4-14-1-چیدمان با منشور………………………………………………. 76
4-14-2-چیدمان با عدسی شیئی…………………………………….. 76
4-15-تصویر برداری TIRF با توان تفکیک بالا از سلول های زنده……. 78
4-16-عدسی شیئی برای TIRF ا……………………………………….78
4-17-تصحیح عدسی شیئی در میکروسکوپ TIRFا………………… 79
4-18-نوردهی در میکروسکوپ TIRF ا…………………………………80

فصل:5 طراحی مفهومی یک میکروسکوپ TIRF با منبع لیزر

5-1-مقدمه………………………………………………………………………. 83
5-2-طراحی میکروسکوپ TIRF ا…………………………………………….83
5-3-معادلات شدت قطبش ها ………………………………………………84
5-4-لایه ی میانی……………………………………………………………… 88
5-5-محاسبه ی تابش فلوئورسانس………………………………………… 92
5-6-نکاتی در مورد طراحی سیستم……………………………………….. 95
5-7-خلاصه و مقایسه ……………………………………………………….96
5-8-نمودارها………………………………………………………………….. 97

برای دانلود رایگان قسمت های بیشتراز فایل به انتهای مطلب مراجعه کنید

فصل6: نتیجه گیری

منابع……………………………………………………………………………..107

 

ABSTRACT

Microscopes play an essential role in microscopic field and especially in biologic researches and studies. Due to our need to microscopes with high resolution, in this thesis we have tried to describe all high- resolution surface techniques. We first introduce the different types of microscopes and then we explain the general principles of microscopes. Finally, we explaine the basic concept of total internal reflection fluorescence microscope and we do a design of this type of microscope. Graphe of evanescent wave intensity for p and s polarization in total internal reflection fluorescence microscope for a few cases have been plotted. The result show that if we made slide or cover slipe with Bk7 instead of silica, the intensity of evanescent wave is greater and the critical angle is reduced. If we coated slide or cover slipe with metals like Al, Au and Ag it result in increase of p-polarization intensity of evanescent wave and the angle of maximum intensity shifted to higher angles, it is due to surface plasmon excitation. Among them, the aluminum metal deposition is better because it increase the intensity of evanescent wave more than other metals. Laser illumination is better for our work. In most cases, the continuous Ar laser with a wavelength of 488 nm is used.



بلافاصله بعد از پرداخت به ایمیلی که در مرحله بعد وارد میکنید ارسال میشود.


فایل pdf غیر قابل ویرایش

قیمت25000تومان

خرید فایل word

قیمت35000تومان